豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體識別特性與NSP9蛋白結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是α冠狀病毒屬的一個(gè)成員，它能感染各種年齡的豬。近年來，豬流行性腹瀉(PED)的暴發(fā)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV基因組能編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP16)、ORF3、S、M、E、N蛋白，其各個(gè)蛋白在病毒生活周期中發(fā)揮了重要作用。PEDV S蛋白是病毒表面的膜糖蛋白，它在調(diào)控其與宿主細(xì)胞表面受體蛋白的相互作用中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，S蛋白上的抗原表位及受體結(jié)合域可以作為疫苗和抗病毒藥物研

2、發(fā)的靶點(diǎn)。NSP9蛋白具有核苷酸結(jié)合特性，它是病毒復(fù)制復(fù)合體的一員，在病毒復(fù)制等過程發(fā)揮了重要作用。本研究以PEDV S和NSP9蛋白為研究對象，探索了S蛋白的受體識別特性、NSP9蛋白的結(jié)構(gòu)及其核苷酸結(jié)合特性，具體內(nèi)容如下:
　　1.研究了PEDV S蛋白與其蛋白受體pAPN及其輔助受體糖的識別特性。為鑒定PEDV S1蛋白中的受體結(jié)合域，構(gòu)建了5個(gè)不同截短片段的S1蛋白及pAPN蛋白，流式細(xì)胞及ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEDV受

3、體結(jié)合域位于S1蛋白的C端區(qū)域（氨基酸253-638），其受體結(jié)合域比其它冠狀病毒更寬。CHGD-01 S253-638和CV777S249-634片段序列相似度很高，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示它們結(jié)合pAPN的能力相似，表明PEDV經(jīng)典弱毒株和變異毒株受體結(jié)合力沒有明顯差異。PEDV S1C-terminus(S477-629)與TGEV、HCoV-NL63受體結(jié)合域在結(jié)構(gòu)和序列上相似，推測PEDV S1 C-terminus結(jié)構(gòu)中突出于β

4、-barrel區(qū)域頂端的3個(gè)loop也可能參與了受體的結(jié)合，為此，將CHGD-01 S477-629片段的3個(gè)loop分別突變?yōu)镠CoV-NL63對應(yīng)序列或“SGSGS”，ELISA、點(diǎn)雜交、pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變體蛋白沒有完全喪失pAPN結(jié)合力，說明預(yù)測的3個(gè)loop在PEDV S-pAPN互作中并不發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，PEDV展現(xiàn)出不同于TGEV、PRCV及HCoV-NL63的受體識別模式。為確定PEDV S蛋白是否具有

5、糖結(jié)合能力，構(gòu)建了全長S1及7個(gè)截短蛋白，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明S1蛋白的N端具有糖結(jié)合能力，同時(shí)，CHGD-01 S1-324蛋白結(jié)合mucin的能力強(qiáng)于CV777 S1-320蛋白，表明PEDV變異毒株的糖結(jié)合力強(qiáng)于經(jīng)典弱毒株。
　　2.深入研究了PEDV NSP9蛋白的結(jié)構(gòu)及其核苷酸結(jié)合特性。經(jīng)過蛋白的表達(dá)、純化，晶體的初篩、優(yōu)化等過程，解析了NSP9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)顯示NSP9蛋白單體包含7個(gè)β-strand和1個(gè)位

6、于C端的α-helix。PEDV NSP9蛋白有2種二聚體形式:一種由C端的α-helix平行互作形成，氨基酸Gly95、Gly99和Gly102之間形成了主要的疏水性相互作用;另一種由二硫鍵及β-strand4和5之間形成的分子間氫鍵、疏水性相互作用形成。Crosslinking和AUC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NSP9蛋白在溶液中主要以單體和二聚體形式存在。SDS-PAGE及AUC實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)NSP9C59A突變體為單體狀態(tài)，而NSP9G95E,

7、G99E,G102E突變體狀態(tài)與野生型NSP9一致，說明二硫鍵在NSP9蛋白二聚體形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，解析的NSP9C59A突變體的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)果。分析發(fā)現(xiàn)大量帶正電荷的氨基酸分布于NSP9蛋白結(jié)構(gòu)表面，二聚體界面或單體中間區(qū)域展示出很強(qiáng)的帶正電荷的能力，表明這是一個(gè)可供核苷酸結(jié)合的界面。為驗(yàn)證NSP9蛋白中氨基酸Cys59、Gly95、Gly99、Gly102、Lys10、Arg68、Lys69、Arg106是否與其核

8、苷酸結(jié)合能力相關(guān)，構(gòu)建了一系列相關(guān)突變體，EMSA及MST實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NSP9蛋白中參與二聚體形成的關(guān)鍵氨基酸Cys59、Gly95、Gly99、Gly102對其核苷酸結(jié)合力沒有顯著影響，而NSP9蛋白結(jié)構(gòu)表面帶正電荷的氨基酸在核苷酸結(jié)合中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)，PEDV NSP9蛋白與核苷酸結(jié)合力的強(qiáng)弱與核苷酸的長度無關(guān)。
　　PEDV S蛋白和NSP9蛋白在結(jié)構(gòu)及功能上展現(xiàn)出異于其它冠狀病毒的特性，因此，PEDV擁有其獨(dú)特的入侵