Chi和Glu的克隆與維管束特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜(Cucumis melo L.)是世界上廣泛種植的水果之一,故加強(qiáng)抗病性甜瓜品種尤其是廣譜抗性品種的選育是提高甜瓜品質(zhì)和產(chǎn)量的關(guān)鍵.本研究從美洲黑楊葉片中提取基因組DNA,克隆到維管束特異性表達(dá)蛋白(BSP)基因啟動(dòng)子功能區(qū)段,分子大小為860bp,其中富含A/T的區(qū)域和富含A/T的重復(fù)序列.通過(guò)序列對(duì)比分析與已報(bào)道的堿基序列有98.2﹪的同源性.以綠色熒光蛋白(GFP)基因?yàn)閳?bào)道基因,通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草維管組

2、織的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明,該啟動(dòng)子具有維管組織特異性表達(dá)活性.設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物,采用PCR擴(kuò)增技術(shù)從質(zhì)粒pART27Tch中克隆到木霉幾丁質(zhì)酶(Chi)基因,該片段分子大小為1275bp,通過(guò)序列分析與文獻(xiàn)報(bào)道的堿基序列有99.45﹪的同源性.同時(shí)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物,從質(zhì)粒pBLGC中克隆到煙草β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因,該片段分子大小為1088bp,通過(guò)序列分析與文獻(xiàn)報(bào)道的堿基序列有99.81﹪的同源性.將Chi和Glu基因分別插入

3、到微生物表達(dá)載體pET28a(+)的T7啟動(dòng)子和終止子之間,構(gòu)建成N-端攜帶6×His標(biāo)簽子的原核表達(dá)載體,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),提取表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定,分別得到分子量約49.5kDa和42.5kDa的特異蛋白條帶,證明Chi和Glu基因的表達(dá)產(chǎn)物的分子量與理論推算的相符.將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶都對(duì)真菌有很強(qiáng)的抑制作用.構(gòu)建了具有BSP-Chi-終止子和

4、具有BSP-Glu-終止子的表達(dá)載體pBIC和pBIG,然后切下載體pBIG上的具有BSP-Glu-終止子的片段,插入到載體pBIC,構(gòu)建了雙價(jià)植物表達(dá)載體pBIBCG:采用直接導(dǎo)入法已將雙價(jià)表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404得到了工程菌.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,對(duì)甜瓜葉片和莖段進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,從不同受體材料的轉(zhuǎn)化效果來(lái)看,試管苗葉片是遺傳轉(zhuǎn)化的較好材料,具有愈傷誘導(dǎo)率高,分化再生能力強(qiáng),取材方便的突出優(yōu)點(diǎn).對(duì)2號(hào)和5號(hào)甜瓜品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研