Chi和Glu的克隆與維管束特異啟動子驅動的表達載體構建及其對甜瓜的遺傳轉化.pdf

1、甜瓜(Cucumis melo L.)是世界上廣泛種植的水果之一,故加強抗病性甜瓜品種尤其是廣譜抗性品種的選育是提高甜瓜品質和產量的關鍵.本研究從美洲黑楊葉片中提取基因組DNA,克隆到維管束特異性表達蛋白(BSP)基因啟動子功能區(qū)段,分子大小為860bp,其中富含A/T的區(qū)域和富含A/T的重復序列.通過序列對比分析與已報道的堿基序列有98.2﹪的同源性.以綠色熒光蛋白(GFP)基因為報道基因,通過基因槍法轉化煙草葉片,通過轉化煙草維管組

2、織的瞬時表達結果表明,該啟動子具有維管組織特異性表達活性.設計特異擴增引物,采用PCR擴增技術從質粒pART27Tch中克隆到木霉幾丁質酶(Chi)基因,該片段分子大小為1275bp,通過序列分析與文獻報道的堿基序列有99.45﹪的同源性.同時設計特異擴增引物,從質粒pBLGC中克隆到煙草β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因,該片段分子大小為1088bp,通過序列分析與文獻報道的堿基序列有99.81﹪的同源性.將Chi和Glu基因分別插入

3、到微生物表達載體pET28a(+)的T7啟動子和終止子之間,構建成N-端攜帶6×His標簽子的原核表達載體,通過IPTG誘導表達,提取表達產物,進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定,分別得到分子量約49.5kDa和42.5kDa的特異蛋白條帶,證明Chi和Glu基因的表達產物的分子量與理論推算的相符.將表達產物進行抑菌實驗,結果表明:幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶都對真菌有很強的抑制作用.構建了具有BSP-Chi-終止子和

4、具有BSP-Glu-終止子的表達載體pBIC和pBIG,然后切下載體pBIG上的具有BSP-Glu-終止子的片段,插入到載體pBIC,構建了雙價植物表達載體pBIBCG:采用直接導入法已將雙價表達載體質粒導入農桿菌LBA4404得到了工程菌.采用農桿菌介導法,對甜瓜葉片和莖段進行了遺傳轉化,從不同受體材料的轉化效果來看,試管苗葉片是遺傳轉化的較好材料,具有愈傷誘導率高,分化再生能力強,取材方便的突出優(yōu)點.對2號和5號甜瓜品種進行了轉化研