脂多糖對豬組織和IPEC-J2細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)及其對恩諾沙星藥動(dòng)學(xué)的影響.pdf

1、P-gp是由Abcb1基因編碼的分子量為170 kD的藥物外排泵，其在機(jī)體肝臟、腎臟、腸道等組織中廣泛分布，故推測其對藥物的吸收和排泄過程也會產(chǎn)生影響。有報(bào)道稱LPS誘導(dǎo)的炎癥會引起嚙齒類動(dòng)物和人P-gp表達(dá)和活性的改變，進(jìn)而使得口服底物藥物的生物利用度發(fā)生改變，影響藥物療效的發(fā)揮。有關(guān)P-gp的研究大多集中在腫瘤細(xì)胞和人類以及嚙齒動(dòng)物上，而在豬上的研究非常有限，尤其LPS處理對豬組織中P-gp表達(dá)和活性的影響更為少見。本文以此為切入點(diǎn)

2、，研究了LPS對豬肝臟、腎臟、空腸、回腸和IPEC-J2細(xì)胞系中P-gp表達(dá)的影響及此變化對口服恩諾沙星藥動(dòng)學(xué)的影響，為炎癥狀態(tài)下豬的合理用藥提供理論支持。
　　本試驗(yàn)首先采用熒光定量及免疫組化的方法檢測了LPS處理不同時(shí)間（3h和6h）對健康60日齡三元仔豬肝臟、腎臟、空腸和回腸中P-gp定位和表達(dá)的影響。熒光定量的結(jié)果表明，在LPS處理3h后，各組織內(nèi)Abcb1 mRNA的表達(dá)均下降，且差異顯著或極顯著;6h后空腸內(nèi)Abcb1

3、mRNA與對照相比差異不顯著，其余組織與對照比顯著或極顯著降低。免疫組化的結(jié)果表明P-gp在豬肝臟中主要分布于肝細(xì)胞間的膽小管細(xì)胞膜上，用Image-Pro Plus軟件對其陽性反應(yīng)面積進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)LPS處理3h后膽小管細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)量顯著上升，6h后降至正常水平。豬腎臟中P-gp主要分布于近端小管和遠(yuǎn)端小管的細(xì)胞膜上，LPS處理6h后其在膜上的表達(dá)量顯著升高。豬空腸和回腸中P-gp主要分布于小腸絨毛上皮細(xì)胞頂端和小腸腺靠近

4、腔面細(xì)胞的頂端，LPS處理3h后P-gp表達(dá)在空腸中有上升趨勢，在6h后降低至正常水平，但是LPS對豬回腸中P-gp的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響。該試驗(yàn)表明經(jīng)LPS處理后，P-gp在細(xì)胞膜上的表達(dá)升高，但各組織中Abcb1的總mRNA水平呈下降趨勢。
　　其次，為進(jìn)一步探究LPS對豬組織細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)的影響，本試驗(yàn)檢測了LPS處理對IPEC-J2細(xì)胞膜表面P-gp定位、總mRNA和總蛋白水平的影響。免疫熒光的結(jié)果表明，10μg/mL

5、LPS處理后細(xì)胞膜上P-gp定位并沒有發(fā)生改變，但1h熒光亮度輕微減弱，3 h-24 h增強(qiáng)。熒光定量結(jié)果表明，LPS處理1h后Abcb1 mRNA表達(dá)略微下降，且50μg/mL濃度下差異極顯著;處理3h后，Abcb1 mRNA表達(dá)和對照相比均明顯增加;6h后又顯著降低，但和對照相比差異不顯著;12 h后其表達(dá)逐漸上升接近正常水平;24 h后mRNA的表達(dá)回復(fù)至對照水平。Western blot的結(jié)果顯示，LPS處理1h后細(xì)胞內(nèi)P-gp

6、總體表達(dá)水平呈濃度依賴性的降低;但3h后細(xì)胞內(nèi)P-gp總體表達(dá)水平呈濃度依賴性的增加;而6h后又呈現(xiàn)抑制狀態(tài);12h后1μg/mL組P-gp水平與對照比略有增加，10μg/mL和50μg/mL LPS仍抑制P-gp的表達(dá)，但抑制程度比6h低;24 h后1μg/mL組P-gp表達(dá)量和對照相比又極顯著降低，而另兩個(gè)濃度下P-gp表達(dá)量則逐漸回復(fù)接近對照水平。試驗(yàn)結(jié)果表明LPS處理后P-gp在IPEC-J2細(xì)胞膜上的表達(dá)量變化與豬組織細(xì)胞膜上

7、的表達(dá)變化一致，均呈增加趨勢，但其總RNA和總體蛋白表達(dá)水平與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果相似，均呈下降趨勢。
　　基于之前LPS對豬組織及細(xì)胞P-gp表達(dá)影響的研究結(jié)果，本試驗(yàn)最后采用高效液相色譜的方法揭示LPS通過影響P-gp功能而對恩諾沙星在豬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程產(chǎn)生影響。結(jié)果表明，口服恩諾沙星組中，維拉帕米處理組與對照組相比Tpeak延長(1.81 vs3.18 h)，Ke極顯著降低(0.24 vs0.12 h-1，P＜0.01)，T1/2

8、ke顯著延長(3.02 vs6.33 h，P＜0.05)，AUC0-24h極顯著增加(4.30 vs8.95μg·mL-1·h，P＜0.01)，CL/F極顯著降低(1.23 vs0.57 mg·kg1·h-1/μg·mL-1，P＜0.01)，生物利用度增加(42％ vs78％)，其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與對照比沒有顯著差異;LPS組恩諾沙星在體內(nèi)的吸收相沒有明顯變化，Ke極顯著降低為0.03 h-1(P＜0.01)，達(dá)峰時(shí)間明顯延后，AUC0-2

9、4h增加為7.31μg·mL-1·h(P=0.05)，CL/F降低至0.27 mg·kg-1·h-1/μg·mL-1，V/F為11.10 mg·kg-1/μg·mL-1，生物利用度升高至72％。靜脈注射恩諾沙星組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之間均無顯著差異。結(jié)果表明，維拉帕米和LPS處理均使得恩諾沙星藥時(shí)曲線下面積增加，消除減慢，增加了恩諾沙星的口服生物利用度，推測與P-gp的表達(dá)減少或活性降低有關(guān)。
　　綜上所述，LPS處理使得豬組織及IPEC-