高活性乙醇-乙醛脫氫酶菌株的選育和酶激活劑的理性設(shè)計(jì).pdf

1、乙醇脫氫酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)和乙醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的肝臟、微生物及植物組織中，雖然商品化的ADH多來(lái)源于動(dòng)物組織，但微生物體內(nèi)產(chǎn)生的ADH因來(lái)源豐富，具有廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。人的各種酒精性疾病的發(fā)生與ALDH活性的缺乏有關(guān)，提高ALDH活性的有效方法是使用ALDH激活劑，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer-aideddrugdesign

2、，CADD)模擬選取ALDH的激活劑，提高ALDH的氧化活性，是研究治療酒精性疾病的有效策略。
　　 本研究的實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)論如下:
　　 1)ADH/ALDH高產(chǎn)菌的篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。以醋醅為菌株來(lái)源，以無(wú)糖培養(yǎng)基篩選出產(chǎn)酸活性較強(qiáng)的一株菌株P(guān)h-5，其產(chǎn)酸能力為10.8g/L。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定Ph-5最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母浸粉(15g/L)、葡萄糖(6g/L)、無(wú)水乙醇(30ml/L);最佳培

3、養(yǎng)溫度為37℃。生長(zhǎng)和產(chǎn)酸曲線表示:該菌株48h到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，產(chǎn)酸速度最快;ADH的提取時(shí)間確定為72h，此時(shí)菌產(chǎn)量和ADH比酶活最高。
　　 2)ADH/ALDH的酶活性質(zhì)初步研究。選擇溶菌酶法為提取ADH/ALDH粗酶液的最佳方法，ADH精提條件為50％～65％的硫酸銨飽和度，將比酶活提高3576.35U/mg，純化倍數(shù)為2.7。ADH最適作用pH為7.0左右，而在pH7時(shí)，其pH穩(wěn)定性高;其最適作用溫度為75℃，75℃保

4、溫1h，其酶活只損失9.90％，證明它是一種耐熱的酶。
　　 3)利用BioSolveITLeadIT軟件進(jìn)行分子對(duì)接。ALDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)源于RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(ID:3INJ)，從ZINC、PubchemCompound、TCMDatabase等配體庫(kù)選取25個(gè)可能提高ALDH活性的小分子配體。LeadIT軟件模擬了這25種小分子配體與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合構(gòu)象，并對(duì)它們進(jìn)行了評(píng)分。
　　 4)酶活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小分子配體4，4