高活性乙醇-乙醛脫氫酶菌株的選育和酶激活劑的理性設計.pdf

1、乙醇脫氫酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)和乙醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)廣泛存在于人和哺乳動物的肝臟、微生物及植物組織中，雖然商品化的ADH多來源于動物組織，但微生物體內產生的ADH因來源豐富，具有廣泛開發(fā)應用價值。人的各種酒精性疾病的發(fā)生與ALDH活性的缺乏有關，提高ALDH活性的有效方法是使用ALDH激活劑，計算機輔助藥物設計(computer-aideddrugdesign

2、，CADD)模擬選取ALDH的激活劑，提高ALDH的氧化活性，是研究治療酒精性疾病的有效策略。
　　 本研究的實驗方法，結論如下:
　　 1)ADH/ALDH高產菌的篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化及發(fā)酵動力學的測定。以醋醅為菌株來源，以無糖培養(yǎng)基篩選出產酸活性較強的一株菌株Ph-5，其產酸能力為10.8g/L。通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定Ph-5最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母浸粉(15g/L)、葡萄糖(6g/L)、無水乙醇(30ml/L);最佳培

3、養(yǎng)溫度為37℃。生長和產酸曲線表示:該菌株48h到達生長穩(wěn)定期，產酸速度最快;ADH的提取時間確定為72h，此時菌產量和ADH比酶活最高。
　　 2)ADH/ALDH的酶活性質初步研究。選擇溶菌酶法為提取ADH/ALDH粗酶液的最佳方法，ADH精提條件為50％～65％的硫酸銨飽和度，將比酶活提高3576.35U/mg，純化倍數為2.7。ADH最適作用pH為7.0左右，而在pH7時，其pH穩(wěn)定性高;其最適作用溫度為75℃，75℃保

4、溫1h，其酶活只損失9.90％，證明它是一種耐熱的酶。
　　 3)利用BioSolveITLeadIT軟件進行分子對接。ALDH蛋白質結構來源于RCSB蛋白質數據庫(ID:3INJ)，從ZINC、PubchemCompound、TCMDatabase等配體庫選取25個可能提高ALDH活性的小分子配體。LeadIT軟件模擬了這25種小分子配體與蛋白質結構結合構象，并對它們進行了評分。
　　 4)酶活實驗驗證小分子配體4，4