樹(shù)突狀細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性矽肺發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制.pdf

1、目的：矽肺是由于長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅（SiO2）粉塵而引起的以肺組織炎癥和廣泛纖維化為特征的一種職業(yè)病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。國(guó)內(nèi)外以往研究發(fā)現(xiàn)，矽肺發(fā)生發(fā)展是多細(xì)胞參與、多因子調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中存在著細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫等多種免疫反應(yīng)，但矽肺免疫的啟動(dòng)與控制、抗原性質(zhì)及抗原遞呈、獲得性免疫應(yīng)答觸發(fā)與功能調(diào)控、免疫耐受與負(fù)相調(diào)控的方式與機(jī)制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚不清楚或存在爭(zhēng)議。既往觀察矽肺免疫效應(yīng)細(xì)胞主要見(jiàn)于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肺上皮

2、細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，而近年來(lái)被證實(shí)處于免疫啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)的樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是否參與矽肺的發(fā)生發(fā)展，尚未見(jiàn)系統(tǒng)化研究報(bào)道。DC與巨噬細(xì)胞有相近、交叉的結(jié)構(gòu)與功能，其免疫反應(yīng)樞紐性作用更為獨(dú)特，且于呼吸系統(tǒng)各部位均有存在，故推測(cè)DC在矽肺免疫反應(yīng)中可能也具有一定的作用。構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性矽肺大鼠模型，輔以體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用免疫組化、細(xì)胞共培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、電子顯微鏡觀察等技術(shù)，系統(tǒng)探索DC在二氧化

3、硅粉塵識(shí)別與攝取、矽肺炎癥與纖維化形成、調(diào)節(jié)矽肺免疫反應(yīng)等方面的作用與機(jī)制，有助于深化對(duì)矽肺發(fā)生發(fā)展過(guò)程的認(rèn)識(shí)，探討潛在的矽肺生物標(biāo)志和關(guān)鍵靶點(diǎn)，并為矽肺預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)和有效干預(yù)研究提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：⑴采用6~8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，體外利用重組大鼠白介素-4(rrIL-4)、重組大鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rrGM-CSF)和重組大鼠TNF-α(rrTNF-α)聯(lián)合誘導(dǎo)，獲得DC

4、。支氣管肺泡灌洗法提取SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AM）。流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分別對(duì)誘導(dǎo)的DC進(jìn)行 CD80、CD86、MHC II表型分子和IL-12p70、IL18細(xì)胞因子檢測(cè)。用流式細(xì)胞術(shù)和熒光倒置顯微鏡檢測(cè)DC對(duì)熒光微球的吞噬功能；光鏡和電鏡下初步觀察DC對(duì)SiO2粉塵的吞噬作用及吞噬前后細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化。CCK8法分別檢測(cè)不同濃度SiO2粉塵在不同作用時(shí)間下DC和AM細(xì)胞活性的

5、影響，確定后續(xù)染毒濃度。在建立DC和AM共培養(yǎng)模型（AM/DC）的基礎(chǔ)上，設(shè)置對(duì)照組（DC組）、共培養(yǎng)組（AM/DC組）、直接暴露組（DC+SiO2組）和間接暴露組（AM+SiO2/DC組），SiO2粉塵暴露48 h后，掃描電鏡下觀察DC的形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表達(dá)和對(duì)熒光微球的吞噬情況；qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)暴露后DC中IL-12、IL-18、TLR4、TLR9、

6、Myd88和NFκB等基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平；尼龍毛柱法分離大鼠脾臟T細(xì)胞，暴露SiO2粉塵后的DC和T細(xì)胞1:10混合培養(yǎng)24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察DC和T細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞分型。⑵SD大鼠60只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組各30只。采用非氣管滴注染塵法建立大鼠矽肺模型，分別于染塵后1周、2周、3周、6周、12周處死（染塵組和對(duì)照組各6只），取肺泡灌洗液、外周血和肺組織。倒置顯微鏡下觀

7、察不同時(shí)段矽肺大鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色），對(duì)大鼠矽肺模型進(jìn)行鑒定；投射電鏡檢測(cè)肺泡內(nèi)DC對(duì)SiO2粉塵的吞噬。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液中DC、Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量變化和外周血中DC的數(shù)量分布變化；Polymer雙色免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織中同部位 DC（OX62+細(xì)胞）和AM（CD68+細(xì)胞）的數(shù)量與分布；ELISA法檢測(cè)肺組織中Th1、Th2型細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的表達(dá)。另選10只SD大鼠，將活細(xì)胞熒光標(biāo)記染料（C

8、arboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE）標(biāo)記的DC通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入大鼠體內(nèi)，然后立即非氣管滴注染塵法對(duì)大鼠進(jìn)行SiO2粉塵暴露，于染塵3周后處死，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液中CFSE+DC占總DC的比例。⑶運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析，結(jié)果以?±s表示，兩組間均數(shù)比較采用Student’s t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，多組間的比較采用單因素

9、方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：①通過(guò)細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠外周血單核細(xì)胞12d后，顯微鏡下可觀察到DC形成眾多的細(xì)胞集落，細(xì)胞表面有大量的皺褶和突起，細(xì)胞內(nèi)有豐富的細(xì)胞器和少量的空泡；DC的熒光微球吞噬率、DC細(xì)胞表型分子CD80、CD86、MHC II和分泌的細(xì)胞因子IL-12p70、IL-18均在第12天達(dá)到較高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②SiO2粉塵染毒后，D

10、C和AM的細(xì)胞存活率均隨著 SiO2粉塵濃度的增高而降低，相同染毒濃度下隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SiO2粉塵染毒12h后，80、100、120、140μg/ml劑量下DC的細(xì)胞存活率高于AM，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SiO2粉塵染毒24h和48h后，20、40、60、80、100、120、140μg/ml劑量下DC的細(xì)胞存活率高于AM，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。③電鏡下觀察到DC

11、可以胞吞的形式吞噬SiO2粉塵，吞噬SiO2粉塵后細(xì)胞體積變大出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，表面的褶皺變淺或消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，細(xì)胞器減少，所吞噬的SiO2粉塵主要位于 DC細(xì)胞空泡內(nèi)。與對(duì)照組相比，直接暴露組 DC對(duì)熒光微球的吞噬率下降，間接暴露組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組和共培養(yǎng)組相比，直接暴露組和間接暴露組DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。直接暴露組 DC

12、中 IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；間接暴露組 DC中 IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。直接暴露組 DC中IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達(dá)水平高于間接暴露組，差異具有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義（P＜0.05）。SiO2粉塵暴露后的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，CFSE熒光標(biāo)記的T細(xì)胞會(huì)被直接暴露組和間接暴露組的DC吞入胞內(nèi)，與對(duì)照組相比，T細(xì)胞存活數(shù)量減少；Th2細(xì)胞比例增高，Th1細(xì)胞比例下降，Th1/Th2比值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。④光鏡下可見(jiàn)染塵1、2周的大鼠肺泡腔有大量的炎性細(xì)胞聚集，肺間隔增寬；染塵3周時(shí)肺組織中出現(xiàn)眾多的細(xì)胞性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；染塵6周時(shí)有大量的細(xì)胞性結(jié)節(jié)和纖維

14、性結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)間出現(xiàn)融合并形成大的結(jié)節(jié)；染塵12周時(shí)肺組織中可見(jiàn)大量纖維性結(jié)節(jié)，出現(xiàn)肺間隔斷裂和肺泡融合。電鏡下可見(jiàn)染塵3周時(shí)大鼠肺泡內(nèi)的DC吞噬有SiO2粉塵，吞噬后的SiO2粉塵位于細(xì)胞空泡內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)嚴(yán)重空泡化，細(xì)胞表面變得光滑，細(xì)胞器減少或消失，大部分空泡發(fā)生破裂融合。⑤隨著染塵時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠外周血 CD80+DC、MHC II+DC比例逐漸增高，CD80+DC比例在2周時(shí)最高，MHC II+DC比例在3周時(shí)最高；與對(duì)照組相比，

15、2、3、6、12周 CD80+DC、MHC II+DC比例增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著染塵時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肺泡灌洗液中OX62+DC的比例呈增高趨勢(shì)，3周時(shí)達(dá)峰值。染塵2、3、6周時(shí)比例與對(duì)照組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著染塵時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肺組織的OX62表達(dá)呈先增高再降低，3周時(shí)表達(dá)最高。1、2、3、6周時(shí)表達(dá)均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD68表達(dá)呈先降低再增高，6周時(shí)表達(dá)最

16、低；染塵1、2、12周時(shí)表達(dá)均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著染塵時(shí)間延長(zhǎng)，各時(shí)段染塵大鼠肺泡灌洗液中 Th1細(xì)胞比例逐漸降低，Th2細(xì)胞比例逐漸增高，Th1/Th2比值逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，1、2、3周時(shí)Th1細(xì)胞比例增高，1、2周時(shí)Th2細(xì)胞比例降低、12周時(shí)增高，1、2、3周染塵大鼠肺泡灌洗液中 Th1/Th2比值增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，1

17、周和2周染塵組大鼠肺組織中IFN-γ表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1周染塵組大鼠肺組織中 IL-4表達(dá)降低，12周染塵組大鼠肺組織中IL-4表達(dá)增高，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑥與對(duì)照組相比，3周染塵矽肺大鼠肺泡灌洗液中 CFSE+DC陽(yáng)性細(xì)胞占 DC比例顯著增高（P<0.01）。
　　結(jié)論：⑴DC在體外培養(yǎng)和矽肺大鼠體內(nèi)都具有直接吞噬SiO2粉塵的作用，吞噬后的SiO2粉塵位于細(xì)胞空泡內(nèi)。D