豬骨免疫活性肽的酶解工藝及其分離純化的研究.pdf

1、本論文以鮮豬骨為原料，通過木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶等三種酶制備豬骨蛋白酶解產(chǎn)物，以小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率為主要指標(biāo)，參考水解度，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件;對在最佳酶解條件下得到的豬骨蛋白酶解產(chǎn)物，通過超濾、凝膠過濾層析以及離子交換層析等分離純化技術(shù)進(jìn)行分離純化以制備出免疫活性肽。主要研究結(jié)果如下:
　　木瓜蛋白酶的水解最佳條件為:時間4h、pH值5.5、酶底比7000 U/g、溫度55℃、底物濃度6

2、％，此時脾細(xì)胞增殖率為79.50％，水解度為18.25％;胰蛋白酶的水解最佳條件為:時間5h、pH值7.5、酶底比5000 U/g、溫度50℃、底物濃度6％，此時脾細(xì)胞增殖率為67.14％，水解度為21.25％; Alcalase堿性蛋白酶的水解最佳條件為:時間4h、pH值9.5、酶底比6000 U/g、溫度45℃、底物濃度6％，此時脾細(xì)胞增殖率為98.41％，水解度為16.82％。Alcalase堿性蛋白酶酶解后的產(chǎn)物脾細(xì)胞增殖率最高

3、。
　　豬骨蛋白酶解液采用截流分子量分別為2Ku、3Ku、5Ku、10Ku的超濾離心管進(jìn)行分離，分離后得到的分子量分別為＞10Ku、5Ku～10Ku、3Ku～5Ku、2Ku～3 Ku和＜2Ku的5個肽段的組分，其中，分子量＜2Ku的肽段組分的脾細(xì)胞增殖率最高，其增殖率為100.89％。對超濾離心后分子量＜2Ku的肽段組分首先采用凝膠過濾層析接著再進(jìn)行離子交換層析分離，其分離結(jié)果顯示:豬骨蛋白酶解液通過凝膠過濾層析之后被分為4個分離

4、峰（即4個組分），其中第2組分對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率最高，且劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為109.83％。第2組分經(jīng)離子交換層析后被分成了9個峰（即9個組分），其中第4組分增殖活性最強(qiáng)，且劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為114.30％。對超濾后分子量＜2Ku的肽段組分首先使用離子交換層析接著再進(jìn)行凝膠過濾層析分離，其分離結(jié)果顯示:豬骨蛋白酶解產(chǎn)物通過離子交換層析后被分成

5、了8個峰（即8個組分），其中第5組分增殖活性最強(qiáng)，且劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為107.97％。第5組分經(jīng)凝膠過濾層析后被分為5個峰（即5個組分），其中第3組分增殖活性最強(qiáng)，且劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為110.95％。
　　通過比較兩種分離純化方法對豬骨蛋白酶解液的分離效果，可以確定最佳的分離純化方法為:豬骨蛋白的酶解產(chǎn)物首先進(jìn)行超濾分離，然后再進(jìn)行凝膠過濾