重組人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α（MIP-3α）的克隆、原核表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α(Macrophageinflammatoryprotein3-α，MIP-3α)，是趨化因子(Chemokine)超家族成員。主要由表皮細(xì)胞或粘膜上皮細(xì)胞分泌的一類CC族趨化因子，特異性趨化郎格罕細(xì)胞(LangerhansCells，LC)向表皮或粘膜上皮遷移。已知LC是皮膚中最重要的抗原遞呈細(xì)胞，決定了皮膚組織的免疫反應(yīng)特征，是異體皮膚移植后發(fā)生免疫排斥的主要原因；同時(shí)MIP-3α也具有趨化未成熟樹突狀細(xì)胞(DC

2、)和淋巴細(xì)胞的功能，在炎癥和腫瘤發(fā)生中起重要作用。作為趨化因子的重要的組成部份，越來越受到人們的關(guān)注。目前對(duì)MIP-3α的研究尚處于初步階段。為此我們克隆了人MIP-3α成熟蛋白基因，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行了重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的鑒定，旨在為進(jìn)一步研究MIP-3α在腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病中的作用機(jī)制及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并且并以此為基礎(chǔ)，獲得多個(gè)MIP-3alpha突變體蛋白，再從突變體中尋找具

3、有拮抗CCR6活性的蛋白，然后在小鼠模型上觀察，拮抗CCR6對(duì)減輕炎癥的發(fā)生、降低皮膚排斥反應(yīng)等方面的影響。該項(xiàng)研究取得的主要結(jié)果如下： 1.從人扁桃體中提取RNA，RT-PCR成功獲得編碼人MIP-3α成熟蛋白的DNA片段，并將該片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/MIP-3α(+3)，通過突變?nèi)サ裟康幕蚺c腸激酶位點(diǎn)間的三個(gè)氨基酸，經(jīng)測(cè)序，與GenBank上登錄的人MIP-3

4、α成熟蛋白cDNA序列完全一致，獲得MIP-3α天然蛋白的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/MIP-3α。 2.將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21trxB(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得了高水平表達(dá)的融合蛋白(TrxA-MIP-3α)，并確定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為終濃度0.2mmol/L的IPTG在18℃誘導(dǎo)表達(dá)15小時(shí)。SDS-PAGE分析可見，表達(dá)蛋白的大小約為25KD，占菌體總蛋白的30

5、％以上，可溶性蛋白約占總?cè)诤系鞍椎?0％。 3.將大量表達(dá)的融合蛋白經(jīng)TALON金屬親和樹脂純化、除鹽、強(qiáng)陽離子交換層析、再除鹽、腸激酶消化、弱陽離子交換層析，得到高純度的MIP-3α重組蛋白。純化后的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。 4.用MIP-3α多克隆抗體進(jìn)行Westernblot分析顯示，證實(shí)融合蛋白與MIP-3α均能與MIP-3α多克隆抗體特異性結(jié)合，而對(duì)照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3