青楊脊虎天牛細胞色素P450基因的克隆與表達及氰戊菊酯對其的誘導作用.pdf

1、細胞色素P450單加氧化酶系在生物體對外源化合物的代謝和內(nèi)源化合物的調(diào)節(jié)都起著非常重要的作用，許多證據(jù)表明昆蟲殺蟲劑抗性的產(chǎn)生與單加氧化酶系介導的代謝反應有關，其關鍵組份細胞色素P450作為終端氧化酶能氧化多樣的底物。青楊脊虎天牛是一種危害楊樹、柳樹等多種闊葉樹的蛀干性害蟲，在我國東北局部地區(qū)造成了嚴重的危害。為深入了解青楊脊虎天牛細胞色素P450的結(jié)構(gòu)與功能，就青楊脊虎天牛細胞色素P450基因的克隆、表達及誘導開展了研究，主要研究結(jié)果

2、如下：
　　根據(jù)報道的十幾種昆蟲CYP4家族基因的氨基酸序列的保守區(qū)域設計一對引物，采用RT-PCR方法以青楊脊虎天牛中腸為材料提取mRNA，克隆了青楊脊虎天牛CYP4G2基因(GenBank登錄號:EF429250)。序列分析表明，青楊脊虎天牛CYP4G2基因編碼區(qū)閱讀框全長387bp，編碼129個氨基酸殘基，預測分子量和等電點分別為16.9KD和5.75;推導的氨基酸序列與已報道的昆蟲CYP4家族氨基酸序列同源性較高(63％～

3、86％)經(jīng)與已知CYP4家族其它幾乎所有成員氨基酸同源比對發(fā)現(xiàn)，青楊脊虎天牛CYP4G2基因與馬鈴薯甲蟲和赤擬谷盜親源關系最近。
　　將青楊脊虎天牛CYP4G2基因克隆進原核表達載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109細胞中，經(jīng)0.3 mmol/L IPTG誘導蛋白質(zhì)表達。SDS-PAGE電泳分析表明在約22kD大小位置，轉(zhuǎn)化青楊脊虎天牛CYP4G2基因的JM109菌與對照JM109菌和空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化JM10

4、9菌相比都出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，與預期大小一致，推測青楊脊虎天牛CYP4G2基因在大腸桿菌中得到表達。
　　將氰戊菊酯配制成2mg/g的濃度，點滴于青楊脊虎天牛體壁，處理不同時間后取對照和經(jīng)氰戊菊酯處理的成蟲解剖，分別測定體壁、中腸、脂肪體的P450含量。結(jié)果表明氰戊菊酯對P450酶系中不同的組分具有不同的誘導作用，對中腸P450含量的誘導最為顯著，并表現(xiàn)出了復雜的誘導機制。
　　青楊脊虎天牛CYP4G2基因的成功克