基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的嗜蟲書虱P450基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、嗜蟲書虱Liposcelis entomophila（Enderlein）是一種重要的儲(chǔ)藏物害蟲，大量發(fā)生時(shí)可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且對(duì)化學(xué)藥劑的抗性發(fā)展迅速，已引起全世界儲(chǔ)藏物工作者的高度重視。但與其他儲(chǔ)藏物類害蟲相比，關(guān)于嗜蟲書虱抗性機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒代謝酶，在昆蟲的生命活動(dòng)中具有重要的生理功能。本學(xué)位論文以嗜蟲書虱為研究對(duì)象，圍繞細(xì)胞色素P450介導(dǎo)昆蟲代謝抗性這一科學(xué)問題開展研究工作。具體

2、內(nèi)容包括：測(cè)定嗜蟲書虱對(duì)藥劑的敏感性，明確不同種群的抗性水平；構(gòu)建嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選鑒定具有解毒代謝功能的基因信息；聚焦細(xì)胞色素P450基因，克隆cDNA全長(zhǎng)序列，解析這些基因在不同性別、不同發(fā)育階段以及藥劑誘導(dǎo)后的表達(dá)模式；初步構(gòu)建嗜蟲書虱P450基因真核表達(dá)載體；從生化水平上比較相對(duì)抗性和相對(duì)敏感種群P450s的酶學(xué)特征。研究結(jié)果為探究細(xì)胞色素P450是否參與嗜蟲書虱抗藥性形成提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，在實(shí)踐上為制定嗜蟲書虱可持續(xù)的防控

3、策略提供指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及解毒代謝酶基因的鑒定
　　利用Illumina技術(shù)對(duì)嗜蟲書虱全蟲態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過組裝拼接獲得了54,220個(gè)Unigene，提交至Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對(duì)，得到成功注釋的Unigene分別有33,404、25,637、23,068、11,773和19,355個(gè)；序列同源性分析結(jié)果表明，在Nr數(shù)據(jù)庫中得到注釋

4、的Unigene與體虱相關(guān)基因同源性最高，達(dá)59.93％。GO分析發(fā)現(xiàn)，共有19,355個(gè)Unigene被劃分到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大主要類別的61個(gè)功能組中。在COG功能注釋中，嗜蟲書虱11,773個(gè)Unigene被歸類到25個(gè)COG功能家族中。
　　進(jìn)一步對(duì)嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選與藥劑解毒代謝相關(guān)的基因。根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋，共鑒定得到68個(gè)P450 Unigene，平均長(zhǎng)度為1,124bp，其中35個(gè)Unige

5、ne同CYP3集團(tuán)親緣關(guān)系最近，18個(gè)Unigene屬于CYP4集團(tuán)，有9個(gè)和6個(gè)Unigene分別與CYP2集團(tuán)和線粒體集團(tuán)基因同源性最高；同時(shí)，篩選鑒定出37個(gè)GSTs Unigene，平均長(zhǎng)度為551bp，分屬于Delta、Omega、Sigma、Theta、Zeta以及Microsomal等GSTs家族，其中Delta家族和Sigma家族包含Unigene個(gè)數(shù)最多，分別為17個(gè)和13個(gè)。此外，篩選出19個(gè)CCEs基因，平均長(zhǎng)度為

6、1,427bp，這些CCEs分為6個(gè)分支，Clade A、Clade D、Clade E、Clade F、Clade H和Clade J。
　　2.嗜蟲書虱5個(gè)P450基因的克隆與序列分析
　　基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫P450 Unigene片段信息，通過對(duì)cDNA全長(zhǎng)序列的克隆和測(cè)序驗(yàn)證，獲得5個(gè)嗜蟲書虱P450基因包含完整的開放閱讀框（ORF）的cDNA序列，分別命名為CYP358B1（KT071005）、CYP345P1（KT

7、071006）、CYP4FD2（KT071007、）、CYP4CD2（KT071008）和 CYP6JN1（KT071009）。上述5個(gè)P450基因ORF核苷酸長(zhǎng)度介于1,500-1,554bp，所編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度范圍為499-517aa。通過使用Mega5.05軟件，應(yīng)用Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確這些基因與其他物種相應(yīng)基因的親緣關(guān)系以及潛在的功能，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)P450基因分布在CYP3和CYP4集團(tuán)，說

8、明其有可能參與解毒代謝過程。
　　3.嗜蟲書虱P450基因的表達(dá)模式解析
　　3.1 嗜蟲書虱P450基因在不同性別及不同發(fā)育階段的表達(dá)模式
　　利用qPCR技術(shù)，對(duì)嗜蟲書虱5個(gè)P450具有全長(zhǎng)cDNA序列的基因和12個(gè)基因片段（Unigene17618、Unigene25300、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene18998、Unigen

9、e25537、Unigene12385、Unigene6029、Unigene22015和Unigene25076）在不同性別中和不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5個(gè)P450基因和10個(gè)Unigene（Unigene25300、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene18998、Unigene25537、Unigene12385、Unigene

10、6029和 Unigene22015）在雌成蟲的表達(dá)量均高于雄成蟲，相反，其余2個(gè)Unigene（Unigene17618和Unigene25076）在雌成蟲的表達(dá)量顯著低于雄成蟲。對(duì)嗜蟲書虱5個(gè)P450基因及12個(gè)Unigene在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，17個(gè)基因在整個(gè)發(fā)育階段均表達(dá)，且在成蟲期的表達(dá)水平高于若蟲期或卵期。其中，CYP345P1、CYP4CD2、CYP4CD2、CYP6JN1以及9個(gè)Unigene（U

11、nigene17618、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene25537、Unigene6029、Unigene22015和Unigene25076）在卵期及若蟲期表達(dá)量較低，隨著若蟲羽化為成蟲后，mRNA表達(dá)水平顯著增高，說明以上13個(gè)基因可能主要在成蟲期行使重要的作用。而CYP358B1和Unigene25300在卵期的相對(duì)表達(dá)量較高，推測(cè)其與卵期生理活動(dòng)

12、及適應(yīng)外界環(huán)境有關(guān)。
　　3.2 嗜蟲書虱P450基因?qū)λ巹┟{迫的響應(yīng)模式
　　在生物測(cè)定基礎(chǔ)上，通過不同類型藥劑（擬除蟲菊酯類、有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類）對(duì)嗜蟲書虱進(jìn)行脅迫，分析P450基因的響應(yīng)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜蟲書虱P450基因?qū)︸R拉硫磷脅迫的響應(yīng)最為明顯，經(jīng)藥劑誘導(dǎo)后，5個(gè)P450基因和5個(gè)Unigene（Unigene26646、Unigene13178、Unigene18998、Unigene12385和Unige

13、ne25537）在12h達(dá)到表達(dá)高峰，其中CYP4CD2和CYP6JN1誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)幅度較大，分別為對(duì)照的9.77和9.47倍；24h后，多數(shù)基因的表達(dá)量又回落至對(duì)照組水平，這暗示P450基因?qū)τ袡C(jī)磷類殺蟲劑反應(yīng)迅速且劇烈，但在體內(nèi)的代謝率可能比較緩慢。嗜蟲書虱多數(shù)P450基因可被溴氰菊酯誘導(dǎo)上調(diào)，其表現(xiàn)出的誘導(dǎo)效應(yīng)相對(duì)滯后，表達(dá)高峰多出現(xiàn)在藥劑處理24h后，其中CYP345P1、CYP4CD2和CYP6JN1的相對(duì)表達(dá)量在誘導(dǎo)后不同時(shí)

14、間段呈現(xiàn)出拋物線的變化趨勢(shì)，而CYP4FD2在脅迫初期表達(dá)受到抑制，隨后逐漸升高，在處理36h后達(dá)到高峰。此外，Unigene25076和 Unigene22015的表達(dá)量在24h后出現(xiàn)一個(gè)峰值，而Unigene27020、Unigene25537、Unigene6029、Unigene18998和Unigene6837在藥劑誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著降低。嗜蟲書虱P450基因經(jīng)殘殺威誘導(dǎo)后，CYP358B1和CYP6JN1的表達(dá)量在殘殺威（LC

15、50）誘導(dǎo)后出現(xiàn)一定程度上調(diào)，而CYP345P1、CYP4FD2和CYP4CD2基因經(jīng)殘殺威誘導(dǎo)后，其表達(dá)先受到一定程度的抑制，隨后隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)量逐漸上升；Unigene17618、Unigene25300、Unigene26646、Unigene13178、Unigene18998和Unigene12385的表達(dá)量在4個(gè)時(shí)間段內(nèi)的變化呈拋物線性，Unigene6837、Unigene25537、Unigene6029和U

16、nigene22015的表達(dá)量變化在誘導(dǎo)后的時(shí)間段內(nèi)呈 W型，Unigene25076的表達(dá)量在受到藥劑誘導(dǎo)后顯著下調(diào)，于24h上調(diào)至最大值，隨后回落直至低于對(duì)照組。
　　3.3 嗜蟲書虱P450基因在不同種群間的表達(dá)模式
　　以隨州種群的表達(dá)量為基準(zhǔn)，其它種群相對(duì)表達(dá)量與之比較，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因在銅梁種群的表達(dá)豐度均顯著高于該基因在隨州種群的表達(dá)量，分別是在隨州種群中表達(dá)量的3.84、2.08、4.38、8.03和13.13倍

17、。其中CYP345P1和CYP4CD2在海南種群的表達(dá)量也相對(duì)較高，與隨州種群相比，分別約為5.00和6.37倍。
　　4.嗜蟲書虱抗性和敏感種群P450酶活性比較
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的嗜蟲書虱不同種群進(jìn)行藥劑（溴氰菊酯、馬拉硫磷和殘殺威）敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨州種群對(duì)所測(cè)藥劑相對(duì)敏感，而銅梁種群抗性水平相對(duì)較高。據(jù)此，分析這2個(gè)種群P450酶活性的差異。結(jié)果表明，相對(duì)抗性種群的P450酶活性高于相對(duì)敏感種群，二者相差1.93倍。

18、經(jīng)藥劑脅迫后，P450s活性均呈現(xiàn)不同程度上升。其中，馬拉硫磷處理后P450s的活性是對(duì)照的2.97倍，且差異顯著；溴氰菊酯處理后P450s活性是對(duì)照的2.35倍。上述結(jié)果暗示細(xì)胞色素P450可能參與介導(dǎo)嗜蟲書虱抗性的形成，推測(cè)細(xì)胞色素P450能對(duì)不同類型的殺蟲劑產(chǎn)生代謝作用。
　　5.嗜蟲書虱P450基因真核表達(dá)載體構(gòu)建
　　選取嗜蟲書虱在藥劑處理后 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著變化的CYP4FD2為對(duì)象，采用雙酶切及DNA重組