Exendin-4抑制t-BHP誘導的HUVECs凋亡-與PI3k-Akt-Bcl-2通路有關.pdf

1、背景和目的：內皮細胞在修復血管損傷和保持血管內膜完整性方面具有強大功能。內皮細胞凋亡的異常增加是動脈粥樣硬化起始和發(fā)展的重要因素。本課題研究氧化應激誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡過程中細胞存活信號通路PI3k/Akt-Bcl-2的分子變化，并在此基礎上加用GLP-1受體激動劑Exendin-4，研究其對氧化應激誘導的內皮細胞凋亡的作用，以及該作用與上述通路的關系，從而初步探討Exendin-4的內皮保護機制。
　　 方法：以體外培養(yǎng)的

2、HUVECs為研究對象。不同濃度（50～800μmol/L）t-BHP處理HUVECs 1～4 h，MTT法測內皮細胞生存率；Hoechst/PI雙染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡率；Western blot測Akt、p-Akt、Bcl-2以及caspase-3在t-BHP（100μmol/L）作用下各時間點（0、0.5、1、2、4、6 h）的表達情況。在參照第一部分的基礎上，不同濃度的Exendin-4（2.5～25 nmol/L）預處理H

3、UVECs 18 h，適宜濃度t-BHP（100μmol/L）誘導的內皮細胞凋亡，再次用MTT法和Hoechst/PI雙染熒光顯微鏡觀察內皮細胞生存及凋亡情況。Exendin-4（25 nmol/L）預處理細胞18 h，加用PI3k抑制劑wortmannin (100nmol/L)，Western blot檢測各組凋亡分子caspase-3以及PI3k/Akt-Bcl-2通路蛋白分子表達的變化。
　　 結果：t-BHP呈時間和濃

4、度依賴性地抑制HUVECs生存；進一步Hoechst/PI染色熒光顯微鏡觀察證實這種抑制作用是誘導HUVECs發(fā)生凋亡和壞死。當t-BHP濃度在50～100μmol/L時，HUVECs以凋亡為主（8.2％±0.59、37.3％±1.65，P＜0.01）；當t-BHP濃度大等于200μmol/L時，HUVECs以壞死為主（4.3％±0.57，15.5％±1.38，36.2％±2.19，P＜0.01）；Western blot結果顯示cas

5、pase-3的活化片段在4 h表達量最高。活化的Akt在30min時表達達高峰，隨后降低。Bcl-2表達呈現遞減的趨勢。加用Exendin-4后，發(fā)現用Exendin-4 （25 nmol/L)預處理過的內皮細胞生存率與單獨t-BHP處理組相比增加了46.5％（P＜0.01），而細胞凋亡率與單獨t-BHP處理組相比也顯著下降(8.0％±1.45vs36. 0％±1.25, P＜0.01）。Western blot結果顯示與t-BHP單獨

6、處理組相比， Exendin-4+t-BHP處理組的caspase-3活化片段的表達量下降了48.53％（P＜0.01），p-Akt表達量增加了1.78倍（P＜0.01），同時Bcl-2的表達也增加了1.08倍（P＜0.01）。表明Exendin-4能夠抑制t-BHP誘導的HUVECs凋亡。但這一效應能夠被PI3k的抑制劑wortmannin抑制。
　　 結論：氧化應激誘導caspase依賴的內皮細胞凋亡，這一病理過程與活化Ak