甜菊糖苷類甜味劑的分離純化與生物轉(zhuǎn)化.pdf

1、作為甜味植物，甜葉菊和甜茶葉中含有大量的甜菊糖苷，例如stevioside、rebaudioside C、rebaudioside A和rubusoside。這些甜菊糖苷類物質(zhì)具有高甜度、低熱能特性，適用于糖尿病患者、肥胖癥患者和動脈粥樣硬化病人的飲食中。因此，甜菊糖苷逐漸成為研究的熱點。目前甜菊糖苷已作為甜味劑，用于食品、藥品等領(lǐng)域。
　　 本文主要對甜葉菊中的主要甜味物質(zhì)，以及甜茶葉中的主要甜味物質(zhì)進行分離與純化研究:確定兩

2、種植物中甜味物質(zhì)的提取方案;利用大孔吸附樹脂對兩種植物中的甜味物質(zhì)進行分離;利用制備型高效液相色譜分別對兩種植物的粗提物進行純化;最后，對甜菊糖苷的生物轉(zhuǎn)化進行了初步探索。
　　 1.首先確定了甜葉菊中甜菊糖苷的檢測方法，即利用HILIC色譜柱對其進行分析與定量。確定了甜茶葉中rubusoside的檢測方法，即利用C18色譜柱進行分析與定量。
　　 2.確定了從甜葉菊中提取stevioside、rebaudioside

3、A和rebaudioside C的條件為:固液比1∶10，溫度100℃，提取時間60min，提取三次，提取率為97.23％。確定大孔吸附樹脂分離stevioside、rebaudioside A和rebaudioside C的最佳分離工藝條件:選用HP-20樹脂，上樣濃度為水提三次的原料液（濃度約為6mg/mL），上樣流速4BV/h，上樣量13BV，去離子水洗3BV，用70％乙醇在3BV/h條件下洗脫產(chǎn)品。經(jīng)過HP-20初步分離之后，用

4、D941陰離子交換樹脂進行脫色，水洗得到粗提物。葉片中甜菊糖苷含量為8.21％，將1009甜葉菊葉片按照上述最優(yōu)工藝提取。再利用HP-20樹脂分離純化，可得到14.25g純度為48.9％的粗提物，經(jīng)過D941之后，可以得到10.39g的純度為63.7％的粗提物，樹脂純化的收率為83.0％。利用HILIC制備柱，從甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）粗提物中純化得到三種單體:stevioside、rebaudios

5、ide C和rebaudioside A。純化條件如下:色譜柱Venusil HILIC制備柱(21.2×250mm，5μm100A)，流動相V乙腈∶V水＝83∶17，流速10mL/min，檢測波長213nm。結(jié)果顯示，最大上樣量可達200mg，此時得到79.2mg的stevioside、7.4mg的rebaudioside C和33.7mg的rebaudioside A，純度分別為:97.5％，96.8％和97.2％。
　　

6、3.從甜茶葉中提取rubusoside的工藝:同上，提取收率為97.44％。得到大孔吸附樹脂分離rubusoside的工藝為:上樣液濃度為水提三次的原料液(濃度約為2mg/mL)，上樣流速3BV/h，上樣量13BV;在3BV/h條件下，先用3BV去離子水洗雜質(zhì)，后用3BV的30％乙醇洗脫雜質(zhì)，然后用90％乙醇洗脫產(chǎn)品。再用D941樹脂進行脫色。葉片中甜茶甙含量為4.5％，將1009甜茶葉按照上述最優(yōu)工藝提取，再利用HP-20樹脂分離純化

7、，可得到7.31g純度為52.1％的粗提物，經(jīng)過D941樹脂，可以得到5.22g純度為68.6％的甜茶甙粗品，樹脂純化的收率為82％。利用C18制備柱，從甜茶葉(Rubus suavissimus S.Lee)粗提物中純化rubusoside。確定的工藝條件為:反相C18色譜柱(19×300mm，7μm，Waters)，流動相V甲醇∶V水＝75∶25，流速10mL/min，檢測波長213nm。上樣量為200mg，依然可以達到良好的分離，

8、從而得到123.4mg純度為97.9％的甜茶甙單體。
　　 4.鑒于stevioside有后苦味，rubusoside口感較佳，且甜茶葉的產(chǎn)量較低，因此本文還對stevioside轉(zhuǎn)化為rubusoside的菌株進行了篩選，從而獲得了一株霉菌，用于轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，經(jīng)過HP-20樹脂純化后，得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中甜菊糖苷含量為75.44％，且所含rubusoside、stevioside、rebaudioside C和rebau