納他霉素高產(chǎn)菌株空間育種、工藝優(yōu)化及工業(yè)放大研究.pdf

1、本文對發(fā)酵法生產(chǎn)納他霉素的全過程進行了系統(tǒng)深入的研究和開發(fā)。以褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus) ATCC13326為出發(fā)菌株，對該菌株進行航天搭載等誘變育種獲得了高產(chǎn)菌株，通過對培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進一步人幅度提高了納他霉素的產(chǎn)量，在控制溶氧水平的原則指導下，成功地將發(fā)酵罐規(guī)模從實驗室放大劍18m3，根據(jù)對納他霉素的穩(wěn)定性及溶解性的研究結(jié)果，提出了綠色環(huán)保、收率高的非溶媒提取工藝。本文的主要研究

2、成果包括： (1)建立了發(fā)酵液中納他霉素含量快速測定的雙波長紫外分光度法。該方法具有操作簡一便、準確快捷的特點，可以用于人批量樣品的快速分析，為菌種高通量篩選與發(fā)酵工藝的研究提供了可靠的快速分析方法。 (2)以褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus) ATCC13326為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線、紫外線復合氯化鋰、空間搭載育種及2-脫氧葡萄糖耐受菌株推理選育等步驟，得到了一株解除了葡萄糖代謝產(chǎn)物阻遏

3、的菌株LK04-119。該菌株在以葡萄糖為唯—碳源的情況下，納他霉素的生產(chǎn)能力不受葡萄糖效應的影響，搖瓶發(fā)酵單位達到了1920mg/l，比出發(fā)菌株ATCC13326的發(fā)酵單位318mg/1提高了5倍以上。 (3)通過試驗確定了納他霉素斜面培養(yǎng)溫度、種子培養(yǎng)溫度、種子培養(yǎng)時間和接種量；確定了納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)的最適溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值、搖瓶發(fā)酵周期。進一步采用正交設計及旋轉(zhuǎn)組合設計進行了納他霉素種子及發(fā)酵配方的優(yōu)化。通過搖瓶

4、試驗分別確定了納他霉素的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基配方。納他霉素搖瓶發(fā)酵單位最高達到了5054mg/l，比發(fā)酵起始培養(yǎng)基發(fā)酵單位1975mg/l提高了1.56倍。 (4)考察了2碳至4碳單位的鹽類、酸類、醇類、酯類等前體性物質(zhì)對納他霉素生物合成的影響。結(jié)果表明鹽類及酸類前體體物質(zhì)抑制納他霉素合成，醇類及酯類前體性物質(zhì)則促進納他霉素合成。丙酸鈉對納他霉素合成的抑制作用最強，而正丙醇則對納他霉素發(fā)酵的促進作用最好。氨基酸對納

5、他霉素的生長合成也有一定影響，其中，0.5g/1的L-纈氨酸可以提高納他霉素產(chǎn)量達到27.0％；而加入2g/l的天冬氨酸將使納他霉素產(chǎn)量減少51.5％。 (5)在301發(fā)酵罐中進行了高產(chǎn)菌株LK04-196分批發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的試驗，確定了最優(yōu)控制條件，使納他霉素發(fā)酵單位平均達到了3784mg/l，最高達到了3902mg/1。通過對分批發(fā)酵過程典型代謝過程的分析，確定了流加補糖策略：控制納他霉素發(fā)酵過程中的糖濃度在35g/l以上

6、，補料時間24小時，可以延長發(fā)酵周期至120小時，納他霉素發(fā)酵單位可提高34.6％，達到了5094mg/l。 (6)以納他霉素301發(fā)酵罐控制工藝為基礎，通過調(diào)整通氣量及攪拌速度，控制發(fā)酵過程中的溶氧水平，成功地實現(xiàn)了納他霉素分批發(fā)酵規(guī)模的放大，在1m3、4m3及18m3發(fā)酵罐中納他霉素產(chǎn)量分別達到了4.26g/l、4.05g/l及3.83g/l。建立了支持向量機模型，該模型通過對發(fā)酵過程的學習，可以較好地模擬并預測工業(yè)放大過程

7、中各級發(fā)酵規(guī)模的代謝過程，在18m3發(fā)酵罐由流加發(fā)本酵的納他霉素產(chǎn)量過到了507g/以上201發(fā)本季缸的產(chǎn)量類似究的基礎上提出一條綠色環(huán)保、操作簡單、成本較低的非溶媒提取工藝。采用該工藝制備了高純度納他霉素樣品。對納他霉素產(chǎn)品進行了全面的結(jié)構(gòu)鑒定，證明產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與文獻報道的納他霉素化學結(jié)構(gòu)完全一致。本論文的創(chuàng)新之處在于：建立了發(fā)酵液中納他霉素雙波長分光度分析方法；利用空間搭載育種結(jié)合推理選育技術(shù)，篩選得到了一株完全解除葡萄糖阻遏的菌株：采