MRNA-145負(fù)向調(diào)控catenin-δ1抑制胃癌浸潤(rùn)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證miR-145能否調(diào)控CTNND1的表達(dá)及其定位，研究CTNND1與cadherin家族成員的作用關(guān)系，并深入探討其調(diào)控的分子機(jī)制。此外，我們還將構(gòu)建裸鼠成瘤模型，在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證CTNND1的表達(dá)及定位與胃癌浸潤(rùn)的關(guān)系。
　　方法:
　　1.本研究對(duì)126例臨床胃癌標(biāo)本和50例非腫瘤胃黏膜組織進(jìn)行免疫組化方法檢測(cè)CTNND1的表達(dá)和觀察其細(xì)胞定位情況，并進(jìn)一步分析其表達(dá)和定位與臨床病理

2、參數(shù)的關(guān)系。
　　2.利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)對(duì)兩組胃癌患者（陰性與陽(yáng)性，膜定位與漿定位）的總體生存率和無(wú)瘤生存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討CTNND1的表達(dá)及其定位與胃癌患者生存率的關(guān)系。
　　3.通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素和多因素統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證CTNND1漿定位能否作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　4.構(gòu)建CTNND1過(guò)表達(dá)和siRNA質(zhì)粒，將CTNND1

3、cDNA和CTNND1 siRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使CTNND1的表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，然后驗(yàn)證其生物學(xué)功能。通過(guò)Transwell小室，MTS實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CTNND1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力、增殖和凋亡作用的影響。
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌組織中miR-145的表達(dá)情況，評(píng)估m(xù)iR-145與總體CTNND1的陽(yáng)性表達(dá)率是否存在相關(guān)性。同時(shí)擴(kuò)增CTNND13'-UTR區(qū)序列，構(gòu)建pmirGLO熒光素酶載體，通過(guò)雙熒光

4、報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)和western blot分析驗(yàn)證CTNND1是否受到miR-145的調(diào)控。
　　6.對(duì)臨床樣本中miR-145與膜定位和漿定位的CTNND1的陽(yáng)性表達(dá)率分別進(jìn)行相關(guān)性分析，驗(yàn)證miR-145對(duì)CTNND1定位是否具有調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)染miR-145和miR-control,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和western blot實(shí)驗(yàn)，觀察CTNND1，E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)及細(xì)胞定位的情況。進(jìn)行N-cad

5、herin siRNA轉(zhuǎn)染，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和western blot實(shí)驗(yàn)探討N-cadherin在miR-145調(diào)控CTNND1表達(dá)和定位中的作用，進(jìn)一步闡明miR-145調(diào)控CTNND1漿定位抑制胃癌浸潤(rùn)的分子機(jī)制。
　　7.將轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體pEZX-miR-145及pEZX-miR-control的腫瘤細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建成瘤模型。6周后取出裸鼠中瘤體組織，測(cè)量?jī)山M裸鼠瘤體組織的直徑，并對(duì)瘤體切片進(jìn)行H&E和CT

6、NND1免疫組化染色，觀察兩組腫瘤組織浸潤(rùn)和CTNND1定位的情況，體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證CTNND1定位與胃癌浸潤(rùn)的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:在非腫瘤胃黏膜組織中，CTNND1定位于細(xì)胞膜。相比非腫瘤胃黏膜組織，CTNND1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。CTNND1在胃癌組織中的表達(dá)有細(xì)胞膜和細(xì)胞漿兩種定位形式，尤以漿定位居多。CTNND1的總體陽(yáng)性表達(dá)只與胃癌的分化程度和Lauren分型相關(guān)，與其它臨床病理參數(shù)無(wú)密切

7、聯(lián)系。而漿表達(dá)的CTNND與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Lauren分型情況密切相關(guān)。
　　2.Kaplan-Meier生存曲線顯示胃癌患者的總體生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間與CTNND1的定位密切有關(guān)，而與CTNND1的總體表達(dá)情況無(wú)關(guān)。CTNND1漿定位的腫瘤患者生存期更短，預(yù)后更差。
　　3.通過(guò)Cox回歸模型單因素統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)漿定位CTNND1，UICC臨床分期，T分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都是影響胃癌患者

8、預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素統(tǒng)計(jì)分析表明漿定位CTNND1是預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　4.CTNND1 cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后與Mock control組相比，胃癌細(xì)胞SGC7901的遷移和浸潤(rùn)顯著增加，同時(shí)CTNND1 siRNA轉(zhuǎn)染后SGC7901的遷移和浸潤(rùn)能力又明顯下降。MTS實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示CTNND1的表達(dá)下調(diào)后對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡沒(méi)有顯著的作用。
　　5.本研究結(jié)果顯示miR-145的表達(dá)與

9、CTNND1的陽(yáng)性表達(dá)率存在負(fù)相關(guān)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145和CTNND1-pmirGLO載體共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-145后，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTNND1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。以上結(jié)果均提示CTNND1是miR-145調(diào)控的直接靶基因。
　　6.相關(guān)性分析顯示miR-145的表達(dá)與漿定位CTNND1的表達(dá)存在顯著的負(fù)相關(guān)，提示miR-145可能參與了CTNND1定位的調(diào)節(jié)。細(xì)胞

10、免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示:miR-control轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞CTNND1主要定位于細(xì)胞漿，而miR-145轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CTNND1定位于細(xì)胞膜上。本研究進(jìn)一步表明miR-145介導(dǎo)了CTNND1由細(xì)胞漿向細(xì)胞膜定位的改變。隨后我們又檢測(cè)了N-cadherin和E-cadherin的定位情況，發(fā)現(xiàn)與miR-control組相比，miR-145轉(zhuǎn)染組細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)有所降低（熒光強(qiáng)度降低但定位沒(méi)有改變），同時(shí)E-cadherin的定位

11、也由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞膜上。為進(jìn)一步判斷N-cadherin在CTNND1和E-cadherin的定位改變的作用，我們將N-cadherin siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，N-cadherin siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞CTNND1和E-cadherin的表達(dá)也出現(xiàn)了膜定位的改變，這說(shuō)明miR-145介導(dǎo)的CTNND1和E-cadherin定位的改變是通過(guò)N-cadherin的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Western blo

12、t結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-145和N-cadherin siRNA后，CTNND1總蛋白表達(dá)下調(diào)，CTNND1膜蛋白表達(dá)卻增加，而E-cadherin蛋白的表達(dá)量沒(méi)有改變。
　　7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pEZX-miR-145及pEZX-miR-control兩組瘤體的大小沒(méi)有顯著差異。pEZ×-miR-145組瘤體包膜完整，沒(méi)有出現(xiàn)肌肉浸潤(rùn)的現(xiàn)象，免疫組化結(jié)果顯示CTNND1主要定位于細(xì)胞膜。而pEZX-miR-control組瘤體包膜

13、不完整，出現(xiàn)了肌肉和血管浸潤(rùn)的現(xiàn)象，其中CTNND1主要定位于細(xì)胞漿。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示pEZX-miR-145組CTNND1蛋白的表達(dá)明顯低于pEZX-miR-control對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.CTNND1在胃癌組織中高表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞漿。CTNND1的漿定位與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Lauren分型情況密切相關(guān)。
　　2.相比CTNND1膜定位的胃癌患者，漿定位的

14、胃癌患者生存時(shí)間更短，預(yù)后更差。漿定位CTNND1可以作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。
　　3.漿定位的CTNND1表達(dá)上調(diào)可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力，但對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡無(wú)明顯作用。CTNND1有望成為胃癌治療的靶點(diǎn)。
　　4.CTNND1的表達(dá)及定位受到miR-145的調(diào)控。CTNND1表達(dá)上調(diào)的原因在于miR-145表達(dá)的下調(diào)，CTNND1是miR-145的直接靶基因，miR-145不僅能下調(diào)漿定位CTNND1