不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：調(diào)查中國(guó)10家教學(xué)醫(yī)院臨床分離的不動(dòng)桿菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥性；對(duì)碳青霉烯類耐藥的不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究；研究不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的分子機(jī)制，確定β內(nèi)酰胺酶、整合子、外膜蛋白(OMP)及外排泵在多重耐藥和泛耐藥不動(dòng)桿菌屬中所起的作用。 方法：收集2003-2004年兩個(gè)年度北京、上海、廣州等十家教學(xué)醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)的187株鮑曼不動(dòng)桿菌，采用瓊脂稀釋法確定美羅培南、亞胺培南等抗菌藥物對(duì)這些菌株的最低抑菌濃度(M

2、IC)；同時(shí)收集1999-2004年的中國(guó)7家大型醫(yī)院臨床分離出的128株碳青霉烯類耐藥的不動(dòng)桿菌(CRAB)，采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和隨機(jī)引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型對(duì)這些菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，確定這些耐藥株的親緣關(guān)系，并對(duì)北京協(xié)和醫(yī)院CRAB的暴發(fā)流行進(jìn)行臨床回顧性分析；選取10個(gè)不同的耐藥克隆株深入研究碳青霉烯類的耐藥機(jī)制；等電聚焦電泳測(cè)定β內(nèi)酰胺酶的等電點(diǎn)，抑制試驗(yàn)確定酶的類型；堿裂解法提取質(zhì)粒；接合試驗(yàn)確定碳青

3、霉烯類的耐藥基因能否轉(zhuǎn)移；對(duì)β內(nèi)酰胺酶基因TEM、SHV、PER、CTX-M。VEB、GES和碳青霉烯酶基因IMP-、VIM-、OXA-23亞組、OXA-24亞組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及序列分析；對(duì)整合子可變基因進(jìn)行PCR及全長(zhǎng)的序列分析。采用12％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析CRAB菌株的Omp。 采用利血平抑制試驗(yàn)檢測(cè)外排泵的表達(dá)情況。體外在亞MIC濃度的亞胺培南的選擇壓力下，對(duì)全敏感株4

4、As6、三代頭孢菌素耐藥株32號(hào)菌進(jìn)行突變篩選研究，比較母體株和突變子耐藥機(jī)制的差異，確定各種耐藥機(jī)制所起的作用。 結(jié)果:2003～2004年來(lái)自中國(guó)10家教學(xué)醫(yī)院的數(shù)據(jù)顯示，碳青霉烯類美羅培南、亞胺培南的敏感性明顯降低，從2003年的92％降至2004年的80％，其他藥物的敏感性也在降低。頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星的敏感率40.4％-51.5％。對(duì)3個(gè)以上不同類抗菌藥物耐藥的菌

5、株從2003年的33％升至2004年的48％。北京、廣州、福州、杭州、濟(jì)南的8家醫(yī)院均發(fā)現(xiàn)GRAB耐藥克隆的暴發(fā)流行，但這些醫(yī)院流行的耐藥克隆的遺傳背景是不同的。2004年北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)生泛耐藥株P(guān)克隆的暴發(fā)流行，此克隆株波及18個(gè)病房的74個(gè)患者，近59.4％的患者(44例)為感染，主要引起肺部感染和菌血癥，其中菌血癥的死亡率40.2％。此克隆株不同于本院過(guò)去出現(xiàn)的耐藥克隆。對(duì)常用廣譜抗菌藥物均不敏感，僅黏菌素高敏。此10個(gè)克隆株均產(chǎn)

6、多種β內(nèi)酰胺酶：OXA-23型碳青霉烯酶(9個(gè)克隆株)、IMP-8型金屬酶(1株)、PER-1型酶超廣譜β內(nèi)酰胺酶(1株)、高產(chǎn)AmpC酶(10個(gè))、SHV型酶、TEM-1酶及等電點(diǎn)為6.0的酶。這10個(gè)克隆株對(duì)碳青霉烯類、絕大多數(shù)超廣譜頭孢菌素類及青霉素類、紅霉素、氯霉素、利福平均耐藥，2個(gè)克隆株對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星敏感，5個(gè)克隆株對(duì)左氧氟沙星敏感。所有10個(gè)克隆株對(duì)米諾環(huán)素、黏菌素較為敏感。共發(fā)現(xiàn)5種不同結(jié)構(gòu)的整合子，攜帶水

7、解氨基糖苷類、利福平、氯霉素及金屬酶(blaIMP-8)的耐藥基因。大多數(shù)OXA-23型酶的編碼基因位于染色體上，接合試驗(yàn)未能將碳青霉烯類耐藥性轉(zhuǎn)入受體菌。不同克隆株OMP差異很大。利血平試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)外排機(jī)制的高表達(dá)。體外試驗(yàn)在亞胺培南的亞MIC選擇壓力下，從一株全敏感株4As6選擇出多重耐藥的突變株(4As6-3)。OMP20kDa的缺失，OMP29kDa、OMP21kDa的表達(dá)降低是突變子耐藥的主要原因。 結(jié)論:在中國(guó)，不動(dòng)桿

8、菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶最常見的是OXA-23型酶。CRAB克隆株的傳播是造成中國(guó)多家醫(yī)院碳青霉烯類耐藥率增加的重要原因，每家醫(yī)院均發(fā)現(xiàn)CRAB株的暴發(fā)流行。各家醫(yī)院流行的克隆株是不同的。CRAB株引起的感染預(yù)后差，必須采取有效的感染控制措施和抗菌藥物的干預(yù)政策以控制耐藥株的傳播。不動(dòng)桿菌通過(guò)產(chǎn)生多種β內(nèi)酰胺酶(特別是OXA-23型碳青霉烯酶或IMP型金屬酶)、攜帶有不同基因盒的整合子、外膜孔蛋白多個(gè)通道的缺失，共同介導(dǎo)多重耐藥性或泛耐藥性。