脯氨酰羥化酶2在髓核細(xì)胞炎癥中的作用機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景：
　　椎間盤是脊柱的重要結(jié)構(gòu)，它主要由外緣的纖維環(huán)、中間的髓核以及上下終板組成。椎間盤堅(jiān)韌且富彈性，可承受相當(dāng)?shù)膽?yīng)力，緩沖外力對(duì)脊柱的震蕩，從而維持脊柱的各項(xiàng)生理功能。在正常的椎間盤中，除了在軟骨終板和纖維環(huán)外層有少量血管分布，髓核組織是一種無(wú)血供，缺氧的富含水分的膠樣組織。它主要是由少量髓核細(xì)胞和大量細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。而在退變的椎間盤中，髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解，聚蛋白聚糖以及Ⅱ型膠原合成減少，髓核與纖維環(huán)失去明顯界限。各

2、種原因引起的神經(jīng)和血管長(zhǎng)入，破壞了髓核內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致髓核細(xì)胞大量凋亡。
　　椎間盤退變是一種多種因素參與的復(fù)雜過程，諸如遺傳、環(huán)境、損傷、生活習(xí)慣都有可能是發(fā)生退變的重要因素。椎間盤炎癥是椎間盤退變的重要機(jī)制之一。在退變的椎間盤組織中，TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎癥因子表達(dá)明顯升高，它們可以促進(jìn)髓核細(xì)胞表達(dá)各類神經(jīng)和血管生長(zhǎng)因子、基質(zhì)降解酶、趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，介導(dǎo)髓核細(xì)胞分化與凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)降解。而促炎癥因子

3、抑制劑可以明顯緩解髓核炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)髓核細(xì)胞再生以及基質(zhì)合成。近年來，通過細(xì)胞移植、基因治療等手段，對(duì)椎間盤退變進(jìn)行抗炎治療的應(yīng)用研究也取得了可喜的療效。
　　蛋白脯氨酰羥化酶(PHD)是細(xì)胞內(nèi)重要的Fe2+、α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶氧感受器，主要包括PHD1，PHD2和PHD3。在正常氧分壓條件下，它們能夠通過羥基化缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(ODDD)上兩個(gè)關(guān)鍵脯氨酸殘基，使得HIF-1α發(fā)生依賴于pVH

4、L的蛋白酶降解。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，PHD2在髓核細(xì)胞中表達(dá)量最高。PHD2是髓核細(xì)胞中調(diào)控HIF-1α的氧依賴降解的主要因子，而PHD3只在缺氧環(huán)境中參與對(duì)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。PHD2還參與SDC4在髓核細(xì)胞內(nèi)依賴HIF-1α途徑的調(diào)控，影響聚蛋白聚糖以及Ⅱ型膠原的表達(dá)。促炎癥因子可以激活NF-κB通路，促進(jìn)髓核細(xì)胞中PHD3的表達(dá)，而PHD3可以作為NF-κB通路的共激活劑，增加各種分解代謝細(xì)胞因子在髓核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。<

5、br>　　然而，到目前為止，PHD在各類疾病炎癥反應(yīng)中的作用還是存在爭(zhēng)議。一方面，有報(bào)道認(rèn)為PHD在細(xì)胞中可以有促進(jìn)炎癥作用。抑制PHD蛋白可以通過激活HIF-1α或抑制NF-κB通路，有效改善腸粘膜自身免疫功能和腸粘膜屏障功能，從而減輕結(jié)腸炎炎癥。在巨噬細(xì)胞中，PHD抑制劑可以通過阻斷NF-κB通路，抑制粘多糖誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。另一方面，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PHD在細(xì)胞中有減輕炎癥的作用。在腫瘤細(xì)胞中，抑制PHD1或PHD2可以激活NF-κ

6、B通路，而過表達(dá)PHD1通過羥基化IKKβ抑制NF-κB通路，從而起到抗炎作用; PHD3可以通過抑制IKKγ泛素化，減少NF-κB通路激活。因此，不同PHD亞型可以在細(xì)胞內(nèi)起抗炎或促炎作用，這一特點(diǎn)具有組織和細(xì)胞特異性。目前，關(guān)于PHD2在髓核細(xì)胞炎癥中的作用還未見報(bào)道。
　　二、研究目的：
　　1.探索PHD2在髓核細(xì)胞炎癥中的作用;
　　2.研究PHD2與NF-κB信號(hào)通路在髓核細(xì)胞中的相互作用機(jī)制。
　　

7、三、研究方法：
　　1.用慢病毒敲除髓核細(xì)胞的PHD2基因后，再給予TNF-α刺激，收集細(xì)胞RNA、蛋白及條件培養(yǎng)基標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real time RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及細(xì)胞因子抗體芯片(Cytokine Array)方法，分析其與對(duì)照組相比，TNF-α刺激誘導(dǎo)的各種炎癥因子表達(dá)的不同;
　　2.采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，檢測(cè)在髓核細(xì)胞中沉默和過表達(dá)PHD2對(duì)具

8、有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的NRE與SDC4報(bào)告基因的基礎(chǔ)活性的影響，以及對(duì)TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的NRE以及SDC4報(bào)告基因活性的影響;
　　3.采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，檢測(cè)在髓核細(xì)胞中沉默或過表達(dá)PHD2的同時(shí)，過表達(dá)NF-κB/P65，對(duì)NRE與SDC4報(bào)告基因活性的影響;檢測(cè)在基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞:P65-/-MEFs，PHD2-/-MEFs，PHD3-/-MEFs，PHD2-/-PHD3-/-MEFs中，沉默和過

9、表達(dá)PHD2對(duì)NRE報(bào)告基因活性的影響;
　　4.采用免疫共沉淀，免疫熒光共聚焦和Western blot方法，研究PHD2與NF-κB/P65在大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平相互作用，以及亞細(xì)胞定位;
　　5.采用Real-time RT PCR和Western blot方法，研究TNF-α及IL-1β是否能夠調(diào)控PHD2在髓核細(xì)胞中的表達(dá);NF-κB通路抑制劑對(duì)髓核細(xì)胞內(nèi)PHD2的基礎(chǔ)表達(dá)與炎癥因子誘導(dǎo)的表達(dá)的影響;慢病毒敲除

10、NF-κB信號(hào)通路重要基團(tuán)P65或IKKβ對(duì)髓核細(xì)胞內(nèi)PHD2表達(dá)的影響;比較在P65+/+MEFs與P65-/-MEFs中的PHD2表達(dá)。
　　四、研究結(jié)果:
　　1.TNF-α刺激可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞內(nèi)PHD3、SDC4、MMP-3與-13等分解代謝炎癥因子的表達(dá)增多，同時(shí)降低聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)。慢病毒敲除PHD2可以顯著減少TNF-α引起的分解代謝炎癥因子的表達(dá)，并明顯恢復(fù)聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)。Cytokine

11、Array結(jié)果顯示，慢病毒敲除PHD2明顯抑制髓核細(xì)胞條件培養(yǎng)基中由TNF-α刺激誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP8)、促炎癥因子(IL-6與IL-1α)、凋亡配體(Fas ligand)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-NGF)、趨化因子(Thymus Chemokine-1，MIP-3α和MCP-1)等19種細(xì)胞因子增多。
　　2.沉默PHD2可以顯著抑制NRE及SDC4報(bào)告基因的基礎(chǔ)活性以及由促炎因子誘導(dǎo)的活性;但是過表達(dá)PHD2對(duì)NRE及S

12、DC4報(bào)告基因的活性無(wú)明顯作用。當(dāng)突變SDC4報(bào)告基因上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)后，沉默PHD2對(duì)其調(diào)控作用消失。共轉(zhuǎn)染shPHD2與siHIF-1α實(shí)驗(yàn)表明，PHD2對(duì)NRE報(bào)告基因活性的作用與HIF-1并無(wú)關(guān)聯(lián)。
　　3.沉默PHD2可以顯著抑制過表達(dá)P65誘導(dǎo)的NRE和SDC4報(bào)告基因活性增加;過表達(dá)PHD2對(duì)此沒有作用。然而，在慢病毒敲除PHD2基因的大鼠髓核細(xì)胞、P65-/-MEFs和PHD2-/-PHD3-/-MEFs中，

13、過表達(dá)PHD2能夠進(jìn)一步加強(qiáng)過表達(dá)P65引起的NRE活性增加。
　　4.免疫共沉淀結(jié)果證明，在髓核細(xì)胞中PHD2能與P65結(jié)合。在HEK293T細(xì)胞中，免疫共沉淀結(jié)果也證明P65能分別于PHD2和PHD3結(jié)合。免疫熒光共聚焦結(jié)果證實(shí)，用TNF-α刺激髓核細(xì)胞后，大量P65轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與PHD2在核內(nèi)形成共聚焦。細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果與共聚焦實(shí)驗(yàn)一致。
　　5.TNF-α和IL-1β刺激髓核細(xì)胞對(duì)PHD2表達(dá)無(wú)影響

14、。NF-κB抑制劑SM7638能夠抑制PHD2的基礎(chǔ)表達(dá)和促炎因子刺激下的表達(dá)。慢病毒敲除人髓核細(xì)胞內(nèi)P65和IKKβ基因，顯著抑制PHD2的表達(dá)。相比野生型MEFs，PHD2在P65-/-MEFs中的基礎(chǔ)表達(dá)量降低。
　　五、結(jié)論:
　　1.在髓核細(xì)胞中，PHD2可以通過與P65反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)其下游靶基因表達(dá);同時(shí)，PHD2也是NF-κB信號(hào)通路的靶基因，其表達(dá)受NF-kB信號(hào)通路調(diào)控。因此，在髓核細(xì)胞