釀酒酵母Spc29p磷酸化對N-Sfi1p與Spc29p之間相互作用的影響.pdf

1、釀酒酵母釀酒酵母Spc29p磷酸化磷酸化對NSfi1p與Spc29p之間相互作用間相互作用的影響影響PreliminarystudyontheinvolvementofSpc29pphosphylationinregulatingtheinteractionbetweenNSfi1pSpc29pofSacomycescerevisiae學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：蒲琳指導(dǎo)教師：馬平生教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年五月中文摘要中文摘要在釀酒

2、酵母細(xì)胞中，紡錘體極體(spindlepolebodySPB)是它的微管組織中心，在維持細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性上發(fā)揮著極其重要的作用，與高等動物細(xì)胞的微管組織中心即中心體有著很多同源的蛋白組分，高度保守和相似的復(fù)制和分離調(diào)控機(jī)制，已經(jīng)成為中心體復(fù)制與分離研究的模式細(xì)胞器。SPB由SPB主體和半橋兩部分組成。Sfi1p是SPB必需的半橋蛋白，缺失或突變會導(dǎo)致SPB復(fù)制失敗，對SPB正常功能的維持具有十分重要的作用，并且在人類中心體中也存在其同源蛋

3、白hSfi1p。Spc29p是構(gòu)成SPB中央斑塊的必需卷曲螺旋蛋白，是SPB主體蛋白組分，限制溫度下Spc29p的溫度敏感突變會導(dǎo)致SPB無法復(fù)制。實驗室前期的研究結(jié)果表明Spc29p與Sfi1p的N端之間存在強(qiáng)烈的相互作用，這對于早期的SPB的復(fù)制是非常重要的，第一次揭示了SPB主體和半橋之間有直接的聯(lián)系。Spc29p在4個磷酸化位點T18、T159、S187和T240處被蛋白激酶Mps1p磷酸化。本論文對Spc29p的磷酸化對其與N

4、Sfi1p之間相互作用的影響進(jìn)行了初步研究，并進(jìn)一步探討了Spc29p磷酸化對SPB自我組裝過程的影響。該研究為SPB復(fù)制過程的深入研究提供了科學(xué)指導(dǎo)，也對人類中心體的相關(guān)研究具有重要的借鑒意義。本文通過融合PCR、定點誘變技術(shù)及其他克隆手段對SPC29磷酸化位點處的基因序列進(jìn)行修飾，構(gòu)建出處于消除磷酸化狀態(tài)的突變質(zhì)粒pGAD424spc29T18A、T159A、S187A和4A以及處于模擬磷酸化狀態(tài)的突變質(zhì)粒pGAD424spc29T

5、18D、T159D、S187D和4D，經(jīng)過測序分析正確，另外，包括實驗室收藏的質(zhì)粒pGAD424、pGBT9、pGAD424SPC29、pGBT9SPC29、pGBT9SFI1NT(1250)，及質(zhì)粒pGAD424spc29T240A、T240D。將攜帶有SFI1NT的BD載體pGBT9和攜帶有SPC29或spc29各等位基因的AD載體pGAD424共同轉(zhuǎn)化酵母菌PJ694a。通過酵母雙雜交實驗對Spc29p磷酸化機(jī)制對其與NSfi1p

6、之間相互作用的影響進(jìn)行了初步研究。實驗結(jié)果顯示模擬磷酸化狀態(tài)的spc294D與SFI1NT的相互作用與消除磷酸化狀態(tài)的spc294A相比明顯降低，表明Spc29p的磷酸化對其與NSfi1p的結(jié)合有調(diào)節(jié)作用且為負(fù)調(diào)控，即Spc29p磷酸化降低了其與NSfi1p之間的親和力，削弱了兩者之間的相互作用，進(jìn)一步影響了SPB主體與半橋之間的結(jié)合。因此，Spc29p磷酸化作用可能構(gòu)成了一種新型的調(diào)控酵母細(xì)胞SPB復(fù)制的作用機(jī)制。關(guān)鍵詞：釀酒酵母；紡