PPARγ激動(dòng)劑15d-PGJ2聯(lián)合RXRa配體9-cisRA抑制MG-63細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)是細(xì)胞核受體超家族的成員,最初發(fā)現(xiàn)它是脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子,近期研究證明PPARγ也表達(dá)于不同類型的腫瘤細(xì)胞中參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡或分化。某些天然的和人工合成的配體結(jié)合于PPARγ,如天然配體15-脫氧-△12,14前列腺素J2(15d-PGJ2)和脂肪酸衍生物及合成類藥物噻唑烷二酮類能激活PPARγ調(diào)控包括脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)存儲(chǔ)等許多基因的表達(dá)。PPARγ激動(dòng)劑在某

2、些腫瘤中可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或分化而抑制惡性腫瘤發(fā)展,因此其在腫瘤學(xué)中有望成為防治腫瘤的因子之一。維甲酸類受體(RXR)屬于類固醇／甲狀腺激素受體超家族成員,是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,在多方面調(diào)節(jié)多細(xì)胞動(dòng)物生命活動(dòng)。這類受體包括大量天然和合成類視黃醇配體,其中9-順式維甲酸(9-cisRA)是RXR的高效天然配體,可通過消除阻遏狀態(tài)而激活RXR。PPARγ可與RXRα形成一個(gè)異源二聚體而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄活性,引起一系列凋亡相關(guān)基因的表達(dá),促

3、進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡或分化。
　　 目的:
　　 本文以人骨肉瘤細(xì)胞MG-63為靶細(xì)胞,研究PPARγ的內(nèi)源性配體15-脫氧前列腺素2(15d-PGJ2)和維甲酸X受體(RXRα)的配體9-cisRA單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)MG-63細(xì)胞增值活性的影響,探討PPARγ和RXRα配體誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,為抗腫瘤治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)單獨(dú)使用15d-PGJ2或

4、9-cisRA以及兩者聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增值的影響。2.FCM AnnexinV／PI雙染色檢測(cè)藥物干預(yù)后對(duì)MG-63細(xì)胞的周期影響及細(xì)胞凋亡和壞死。3.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)檢測(cè)單獨(dú)使用15d-PGJ2和9-cisRA以及兩者聯(lián)合作用對(duì)MG-63細(xì)胞中PPARγ和RXRα mRNA的表達(dá)影響。4.通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)藥物干預(yù)后MG-63細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase3,p53,Bax／bcl-2的表達(dá)情況。
　　

5、 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示:單獨(dú)使用15d-PGJ2或9-cisRA均能夠抑制細(xì)胞活性,各濃度劑量組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),且隨藥物濃度增加作用增強(qiáng)。藥物作用48h達(dá)到最佳抑制效果,48h、72h及96h無(wú)顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯高于單獨(dú)用藥組(p<0.05)；2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥組細(xì)胞G1期數(shù)量較對(duì)照組明顯增多,S、G2／M期相應(yīng)減少,且細(xì)胞凋亡率增高。聯(lián)

6、合用藥組G1期細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率均明顯高于單獨(dú)用藥組(p<0.05)；3.RT-PCR檢測(cè)PPARγ及RXRα mRNA的表達(dá),并同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定的內(nèi)參片段β-actin,以二者的面積灰度值比值作為該mRNA的相對(duì)表達(dá)量,PPARγ mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組0.94±0.23,5μM9-cisRA組1.85±0.44,20μM15d-PGJ2組2.06±0.35,聯(lián)合組2.44±0.36；RXRαmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組1

7、.06±0.16,5μM9-cisRA組2.13±0.12,20μM15d-PGJ2組1.78±0.31,聯(lián)合組2.33±0.47,各加藥組PPARγ和RXRα mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且聯(lián)合組目的基因表達(dá)均強(qiáng)于單獨(dú)使用組(P<0.05)。4.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:藥物干預(yù)組凋亡相關(guān)蛋白caspase3和Bax表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增加,而p53和bcl-2表達(dá)下降(p<0.05),聯(lián)合用藥組的作用明

8、顯強(qiáng)于單獨(dú)用藥組(p<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.PPARγ激動(dòng)劑15d-PGJ2和RXRα配體9-cisRA及二者聯(lián)合使用均可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng),使細(xì)胞周期停滯在G1期且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。聯(lián)合用藥強(qiáng)于單獨(dú)用藥,表明二者具有相加作用。
　　 2.15d-PGJ2和9-cisRA可能通過增加PPARγ及RXRα mRNA表達(dá),上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase3及下調(diào)bcl-2、p53表達(dá)而