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文檔簡介
1、第一部分、慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞表面的PD-1表達及其影響因素的研究
目的:研究慢性乙型肝炎患者外周血外周血單個核細胞、CD4+T、CD8+T淋巴細胞表達PD-1的情況以及影響PD-1表達的可能的因素。
方法:密度梯度離心法分離63例慢性乙型肝炎患者(其中包括HBeAg(+)患者32例,HBeAg(-)患者31例)、35例乙肝病毒健康攜帶者、18例健康人外周血單個核細胞、CD4+T、CD8+T淋巴細胞
2、中表達PD-1的百分比,分析慢性乙型肝炎患者、乙肝病毒健康攜帶者及健康人PD-1表達的差異;觀察PD-1表達與HBV感染者ALT水平、乙肝e抗原、病毒復制指標HBV-DNA水平之間的關系。
結果:HBV健康攜帶組外周血單個核細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達率最高;CHB組次之;健康對照組最低。HBV健康攜帶組外周血單個核細胞、CD4+T淋巴細胞上PD-1表達顯著高于健康對照組及CHB組,CHB組
3、顯著高于健康對照組(P<0.05)。而CD8+T淋巴細胞上PD-1表達只在健康對照組和HBV健康攜帶組之間比較差異顯著(P<0.05),其他組間比較均無統(tǒng)計學差異。CHB患者外周血單個核細胞、CD4+T、CD8+T淋巴細胞上表達PD-1百分比與血清ALT及HBV-DNA水平無相關性。CHB患者eAg是否陽性對PD-1在外周血單個核細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞表面表達率有一定影響: HBeAg(+)組和HBeAg(-)組外周血單個
4、核細胞表面表達PD-1比率分別為:25.88±20.09%和15.39±10.64%,較健康對照組(10.85±4.45%)明顯升高,HBeAg(+)組和健康對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);HBeAg(+)組PD-1表達比率顯著高于HBeAg(-)組,P<0.01。HBeAg(+)組、HBeAg(-)組、健康對照組CD4+T淋巴細胞表面表達PD-1表達率分別為:9.15±6.46%、8.65±6.84%、2.37±1.16
5、%,HBeAg(+)組及HBeAg(-)組健與康對照組CD4+T淋巴細胞表面PD-1表達率比較,差異均有統(tǒng)計學意義,P<0.01。HBeAg(+)組、HBeAg(-)組、健康對照組CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達率分別為:3.71±2.79%、3.23±2.39%、1.40±0.31%,HBeAg(+)組及HBeAg(-)組健與康對照組CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達率比較,差異有統(tǒng)計學意義,P<0.05。
結論:CH
6、B患者外周血單個核細胞、CD4+T淋巴細胞上PD-1表達顯著高于健康人,又明顯低于HBV健康攜帶者。PD-1表達可能與HBV感染者的免疫狀態(tài)相關。血清HBeAg可以明顯影響CHB患者外周血T單個核細胞表面PD-1的表達,是影響其PD-1表達的重要因素。
第二部分、淋巴細胞系Molt-4細胞PD-1啟動子區(qū)域甲基化水平和PD-1表達的關系的研究
目的:以T淋巴細胞株Molt-4細胞為模型,探討甲基化抑制劑5-雜
7、氮胞苷(5-Zac)對淋巴細胞表面程序性死亡受體-1(PD-1)基因啟動子的去甲基化作用及其誘導的PD-1基因表達的改變,并進一步研究去甲基化作用與PD-1基因表達之間關系。
方法:以不同濃度的5-Zac(0μ mol·L-1、5μ mol·L-1、10μ mol·L-1)作用于體外培養(yǎng)的molt-4細胞72h,流式細胞術(FCM)檢測細胞表面表達PD-1的Molt-4細胞比例和細胞凋亡率;反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PC
8、R)檢測5-Zac作用后PD-1基因mRNA的轉錄水平;亞硫酸氫鈉處理各組Molt-4細胞DNA,PCR擴增PD-1啟動子基因片段,轉化感受態(tài)大腸桿菌,挑克隆測序,檢測擴增的PD-1啟動子片段甲基化狀態(tài)。
結果:0μ mol·L-1、5μ mol·L-1、10μ mol·L-1的5-氮雜胞苷作用于molt-4細胞72h后,PD-1在細胞表面的表達率分別為:1.13±0.01%;18.96±1.87%;63.09±6.25%
9、,并呈現濃度依賴性;PD-1基因mRNA表達量顯著增加;細胞凋亡檢測結果顯示與未處理組相比,加5μ mol·L-1、10μ mol·L-1的5-氮雜胞苷處理72h后molt-4細胞的凋亡率顯著增加,三組凋亡率分別為:1.9%±0.06%;8.98%±1.36%;24.5%±3.68%,有顯著性差異(P<0.01);三組DNA亞硫酸氫鈉測序結果表明,加入甲基化抑制劑5-Zac處理后,PD-1啟動子上-601bp和d-553bp CG點去甲
10、基化程度明顯增高。
結論:甲基化抑制劑5-Zac可導致體外培養(yǎng)的T淋巴細胞系Molt-4細胞表面程序性死亡受體-1(PD-1)表達顯著增加,PD-1基因mRNA表達增加,細胞凋亡率增高,這種增高可能與PD-1基因啟動子區(qū)域出現的低甲基化有關。
第三部分:慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞PD-1基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及影響因素
目的:探討慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞上程序性死亡受體-1表達和
11、PD-1啟動子區(qū)域甲基化水平的關系,以及HBeAg對慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞表面PD-1基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)的影響。
方法:篩選健康對照組10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg陽性者10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg陰性者10例,實時定量聚合酶鏈反應(real-time RT-PCR)檢測外周血單個核細胞中PD-1基因的mRNA表達水平;亞硫酸氫鈉處理PBMCs細胞DNA,PCR擴增PD-1啟動子基因片段,轉化感受
12、態(tài)大腸桿菌,挑克隆測序,檢測擴增的PD-1啟動子片段甲基化狀態(tài)。
結果:與正常對照組(0.10±0.023)比較,慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞中PD-1 mRNA表達水平明顯升高。在慢性肝炎患者中,外周血單個核細胞上PD-1表達在HBeAg陽性患者(0.44±0.046)中顯著高于HBeAg陰性患者(0.18±0.014)。PD-1啟動子上多個CpG點(-601、-553、-538、-483、-463、-317)甲基化
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