尿道下裂患者包皮細(xì)胞中雌激素受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、目的:尿道下裂是由于陰莖尿道發(fā)育異常而導(dǎo)致的，是男性新生兒中最常見的生殖器發(fā)育畸形。盡管研究不斷的深入，尿道下裂的病因仍就有許多的未知。然而，目前正處于尿道下裂病因?qū)W、流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究的新的分水嶺。據(jù)推測(cè)，由內(nèi)源性或外源性因素導(dǎo)致，在陰莖和尿道發(fā)育關(guān)鍵期（8至14周）性激素濃度的變化，可能在尿道下裂的發(fā)生起一部分作用。因?yàn)槟承﹥?nèi)源性或外源性因素，如激素水平，飲食和接觸化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致表觀遺傳改變，特別是在胎兒發(fā)育過程中，母親所暴露

2、的條件。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于探討雄激素受體基因甲基化狀態(tài)與表達(dá)情況以及雙氫睪酮水平是否與尿道下裂的發(fā)生有關(guān)。
　　方法:將15例尿道下裂患者作為實(shí)驗(yàn)組，15例年齡相似的包皮環(huán)切術(shù)患者作為對(duì)照組進(jìn)行研究。
　　1包皮組織以4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)制備病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察組織病理變化。
　　2檢測(cè)各患者血清雙氫睪酮水平?；純貉航?jīng)離心后，上清裝入EDTA管中凍存在-20℃冰箱。使用雙氫睪酮ELISA試

3、劑盒(DiagnosticBiochem，加拿大)檢測(cè)分析血清DHT濃度。血清DHT的檢測(cè)靈敏度為6.0pg/ml。
　　3我們使用實(shí)時(shí)MS-qPCR對(duì)亞硫酸氫鈉處理過的DNA進(jìn)行甲基化分析，因?yàn)檫@種技術(shù)是適合高度敏感和特異的甲基化檢測(cè)。
　　4使用TRIzol（Invitrogen公司）提取總RNA以PrimeScriptTM RTreagent KIT試劑盒（takara，日本）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模

4、板，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)AR-mRNA在包皮組織中的表達(dá)情況(上游引物5'-AAGGCTATGAATGTCAG CCCA-3'，下游引物5'-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC-3')。
　　5提取組織在冰上勻漿提取總蛋白，BCA法測(cè)量各個(gè)組織的蛋白濃度，使用Western-Blot法分析包皮組織中AR基因蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、通過HE染色法觀察組織病理的改變，發(fā)現(xiàn)無論尿道下裂患者，

5、還是包皮環(huán)切術(shù)的患者，組織表皮層都是角化的復(fù)層扁平上皮，上皮由上至下:角質(zhì)細(xì)胞層、透明細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層，真皮層主要為結(jié)締組織。只是相對(duì)于包皮環(huán)切術(shù)患者，尿道下裂包皮組織上皮基底層突觸變多，部分位置棘層、顆粒層變薄，整體分布不均勻。
　　2、通過雙氫睪酮ELISA試劑盒檢測(cè)對(duì)血清DHT濃度的分析。發(fā)現(xiàn)尿道下裂患兒血清DHT水平明顯低于包皮環(huán)切術(shù)患兒（22.17±5.1 vs.123.15±11.9 pg/ml

6、，mean±SE; P＜0.05）。
　　3、通過MS-qPCR對(duì)包皮組織標(biāo)本中AR基因甲基化的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)尿道下裂患者包皮組織標(biāo)本中AR基因甲基化程度高于包皮環(huán)切術(shù)患者。(甲基化百分比:64.1±3.7vs.50.9±2.4，mean±SE; P＜0.05)
　　4、通過qPCR對(duì)組織AR基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)尿道下裂患者包皮組織標(biāo)本中AR基因mRNA表達(dá)程度低于于包皮環(huán)切術(shù)患者。(RQ=0.198±0.028,mea

7、n±SE; P＜0.05)
　　5、通過Western-Blot法分析包皮組織中AR基因蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)尿道下裂患者包皮組織標(biāo)本中AR基因蛋白表達(dá)程度明顯低于包皮環(huán)切術(shù)患者。（OD:0.254±0.288 vs.OD:1.355±0.154，mean±SE; P＜0.05）
　　結(jié)論:多年來，遺傳學(xué)的探索發(fā)現(xiàn)尿道下裂的新的候選基因都集中在DNA序列本身。雖然一些因素可能仍有待確定，可從本實(shí)驗(yàn)來看，DNA甲基化可能是尿道下

8、裂患者在沒有DNA序列變化的情況下出現(xiàn)異常的基因表達(dá)模式。新技術(shù)的改進(jìn)，讓DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)更方便快速，本實(shí)驗(yàn)是第一次在國內(nèi)建立了雄激素受體甲基化狀態(tài)檢測(cè)的MS-qMSP方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論:
　　1、尿道下裂患兒包皮組織，部分位置皮膚棘層、顆粒層變薄，整體分布不均勻，可能與AR受體表達(dá)的減少，尿道下裂的發(fā)生有關(guān)。
　　2、尿下裂患者血清DHT水平明顯降低，可以作為尿道下裂臨床診斷的一個(gè)新指標(biāo)。
　　3、