基于microRNA技術(shù)抑制成熟樹突狀細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗原呈遞.pdf

1、對(duì)于遺傳疾病的基因治療,能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因的長期穩(wěn)定表達(dá)、而不引起宿主免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng),是醫(yī)療界孜孜以求的目標(biāo)。自1990年起,已有1996項(xiàng)基因治療項(xiàng)目進(jìn)入臨床研究,在先天性黑內(nèi)障、血友病等疾病的基因治療中已取得重大突破。但由于基因治療的臨床研究中出現(xiàn)了不同程度的免疫反應(yīng),特別是細(xì)胞免疫毒性,基因治療在臨床研究中的廣泛應(yīng)用受到了限制。
　　基因治療藥物引起細(xì)胞免疫毒性的具體原因尚無定論,目前還沒有適當(dāng)?shù)膽?yīng)對(duì)策略?；跇渫粻罴?xì)

2、胞(DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC),本研究認(rèn)為 DC可能是引起基因治療細(xì)胞免疫毒性的執(zhí)行者。未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)具有極強(qiáng)的抗原攝取能力,一旦有抗原進(jìn)入,立即被iDC攝取,iDC被激活并向遷移淋巴結(jié)遷移,遷移過程中即分化為成熟樹突狀細(xì)胞(mDC), mDC能夠刺激T細(xì)胞分化為特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL),產(chǎn)生細(xì)胞免疫毒性。因此,本課題提出,特異性地減少 mDC內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá),從而降低mDC對(duì)抗原的呈遞,但又不

3、影響轉(zhuǎn)基因在其它正常細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),可能是規(guī)避基因治療藥物因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫毒性的有效方法。
　　MicroRNA(miRNA)是一類具有靶基因調(diào)控功能的非編碼小 RNA,在進(jìn)化過程中高度保守,能與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)進(jìn)行特異性地堿基互補(bǔ)配對(duì),促進(jìn)其剪切、降解或抑制翻譯,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。mDC特異性高表達(dá)miR155的特性,為我們構(gòu)建可以特異性沉默mDC內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體提供了條件。本課題將與mi

4、R155完全互補(bǔ)的結(jié)合序列(miR155T)串聯(lián)插入到載體表達(dá)框的3’UTR中,構(gòu)建了新型基因治療載體,并利用非病毒載體及慢病毒載體驗(yàn)證了我們的學(xué)術(shù)假設(shè)。
　　本研究首先通過新型基因治療載體與miR155 mimic的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了miR155可以有效抑制新型基因治療載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。DC從非成熟到成熟的轉(zhuǎn)化過程中,內(nèi)源性miR155表達(dá)逐漸上升,在轉(zhuǎn)染新型重組載體后,轉(zhuǎn)基因表達(dá)也逐漸降低,符合本研究預(yù)期。隨后,我們以細(xì)胞免疫

5、實(shí)驗(yàn)常用的強(qiáng)抗原蛋白卵白蛋白(OVA)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物,構(gòu)建了含miR155T的新型重組慢病毒載體。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測,在轉(zhuǎn)導(dǎo)不同成熟度的DC后,轉(zhuǎn)基因抗原OVA的抗原肽在mDC表面的呈遞能夠被有效抑制。不同成熟度的DC轉(zhuǎn)導(dǎo)含miR155T的新型重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后,與EdU標(biāo)記的T細(xì)胞共培養(yǎng),可明顯降低對(duì)T細(xì)胞的激活能力。
　　總之,miR155在mDC內(nèi)的特異性高表達(dá),可以有效抑制含miR155T的新型基因治療載體在mDC內(nèi)的轉(zhuǎn)基因