Gli2基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的:探討膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2(Glioma-associated oncogenehomologue2,Gli2)對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:設(shè)計(jì)3條靶向 Gli2基因的 shRNA,構(gòu)建慢病毒載體(pLKD.CMV.GFP.U6 shRNA-Gli2-1,2,3),轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721。采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。利用 qRT

2、-PCR、Western blot法篩選出最佳沉默效率的shRNA慢病毒,并檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Gli2 mRNA和蛋白表達(dá)的情況;實(shí)驗(yàn)設(shè)shRNA-Gli2組(轉(zhuǎn)染shRNA-Gli2的SMMC-7721細(xì)胞)、shRNA-NC組(轉(zhuǎn)染Negative control shRNA的SMMC-7721細(xì)胞)和對(duì)照組(未經(jīng)處理的 SMMC-7721細(xì)胞)。采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞同種及異種黏附率；采用Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移、

3、侵襲能力;采用體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞血管生成能力;利用qRT-PCR和Western blot法分析 Gli2基因沉默對(duì)上皮標(biāo)志物 E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、MMPs家族中MMP-2及血管生成關(guān)鍵調(diào)控因子 VEGF-AmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1．流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染率為95％左右。
　　2．篩選出沉默效果最佳的 shRNA慢病毒shRNA-Gl

4、i2-1,shRNA-Gli2-1組中 Gli2 mRNA的表達(dá)量為對(duì)照組的0.37±0.02倍,Gli2蛋白質(zhì)的表達(dá)量為對(duì)照組的0.43±0.05倍。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以shRNA-Gli2-1轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,命名為shRNA-Gli2組。
　　3．細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNA-Gli2組與 shRNA-NC組和對(duì)照組相比同種黏附率增加(13.71%±1.87 vs6.35%±1.33&5.53%±2.01)(p<0.0

5、5),異種黏附率降低(20.57%±1.44 vs35.64%±2.58&33.34%±1.40)(p<0.05)。
　　4．細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNA-Gli2組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于shRNA-NC組和對(duì)照組(40.00±1.46 vs162.33±12.81&176.67±7.02)(p<0.05)。
　　5．細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNA-Gli2組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于shRNA-NC組和對(duì)照組(18.00±2.6

6、6 vs100.33±3.06&106.33±4.16)(p<0.05)。
　　6．體外血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,shRNA-Gli2組與 shRNA-NC組和對(duì)照組相比血管生成能力明顯減弱(8.67±2.08 vs27.33±2.52&28.33±3.51)(p<0.05)。
　　7．qRT-PCR、Western blot法結(jié)果顯示,shRNA-Gli2組與shRNA-NC組和對(duì)照組相比 E-cadherin表達(dá)顯著增高而 N