CCL18通過PITPNM3促進人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的遷移和浸潤.pdf

1、背景和目的
　　浸潤和轉(zhuǎn)移可發(fā)生在肝癌的各個階段,是治療腫瘤失敗的常見因素,也是腫瘤病人死亡的主要原因之一。大量研究證實,肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移與肝癌的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān),而各種免疫因子、炎癥因子在腫瘤的浸潤和遷移的過程中起重要作用,是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。趨化因子配體CCL18(chemokineCC-motifligand18,CCL18)屬CC族趨化因子,主要由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)分泌,是新近發(fā)現(xiàn)的炎性趨化因子,在正常人

2、血清中可測得,有研究表明,該因子與胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。但有關(guān)CCL18在肝癌中的表達及意義的研究在國內(nèi)外尚未見文獻報道,與肝癌的生物學(xué)關(guān)系尚不明確。本研究通過測定CCL18和它的功能性受體PITPNM3在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達情況,進一步探索CCL18通過其受體在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721黏附、遷移和浸潤過程中所起的作用。
　　材料與方法
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌

3、細(xì)胞株SMMC-7721(細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫)、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(細(xì)胞購自ATCC)均在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含10％胎牛血清的DMEM),人正常肝細(xì)胞株HL-7702(細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含20%胎牛血清的DMEM)。
　　2.用重組CCL18(50ng/ml)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-77215天后,再將SMMC-7721細(xì)胞分成4組,各組分別用不同濃度的CCL18(0、10、20、50ng/m

4、l)處理1小時,檢測其促進細(xì)胞的體外黏附能力。
　　3.用重組CCL18(50ng/ml)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-772110天后,將SMMC-7721細(xì)胞株分成4組,各組分別用不同濃度的CCL18(0、10、20、50ng/ml),用Transwell和劃痕實驗檢測細(xì)胞的體外遷移和浸潤能力。
　　4.用westernblot方法檢測趨化因子配體CCL18的功能性受體PITPNM3在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的表達。分為

5、三組:人正常肝細(xì)胞株HL-7702(陰性對照)、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(陽性對照)、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(實驗組)。采用免疫熒光法證明CCL18和PITPNM3是否共定位于SMMC-7721細(xì)胞的胞膜上。
　　5.用重組CCL18(50ng/ml)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-772110天,再用小分子干擾RNA(siRNA)沉默受體PITPNM3,分為6組(PBS、Un、Monk、GFP-Si、PITPNM3-Si

6、1、PITPNM3-Si2),觀察SMMC-7721細(xì)胞被沉默了受體PITPNM3后的體外浸潤能力。
　　研究結(jié)果
　　1.重組CCL18誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞5天后,發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞的粘附力明顯增加,并具有劑量依賴性,差異性比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P　　2.用重組CCL18誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞10天后,運用Transwell實驗和劃痕實驗方法檢測細(xì)胞體外浸潤能力和細(xì)胞體外遷移能力

7、,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組比較細(xì)胞體外浸潤能力和細(xì)胞體外遷移能力明顯增強,同時具顯著劑量依賴性,差異性比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P　　3.WesternBlot檢測結(jié)果表明,PITPNM3蛋白在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的表達明顯高于人正常肝細(xì)胞株HL-7702的表達水平,并且通過灰度分析證實其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P　　4.激光掃描共聚焦顯微鏡(Laserscanningconfocalmicro

8、scope,LSCM)證明CCL18和PITPNM3共定位于人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的胞膜上。
　　5.重組CCL18(50ng/ml)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-772110天,再用小分子干擾RNA(siRNA)沉默受體PITPNM3,被沉默了趨化因子CCL18的受體PITPNM3后,SMMC-7721細(xì)胞體外浸潤能力明顯下降,差異性比較具顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P　　結(jié)論
　　1.重組CCL18增強了

9、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的體外黏附、遷移和浸潤能力,且呈劑量依賴性。
　　2.PITPNM3蛋白在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中高表達,并顯著高于人正常肝細(xì)胞HL-7702中PITPNM3蛋白的表達水平。
　　3.CCL18及其功能性受體PITPNM3可表達于人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的胞膜上,并能共定位于肝癌細(xì)胞膜表面。
　　4.被沉默了趨化因子CCL18的功能性受體PITPNM3后,人肝癌細(xì)胞株SMMC