shRNA誘導RUNX3沉默對SGC7901細胞系生長的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究運用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術,沉默抑癌基因RUNX3的表達,觀察RUNX3基因轉(zhuǎn)錄水平沉默對人胃癌細胞系SGC7901生長增殖的影響,并探討其可能機制。
　　方法:
　　根據(jù)RNAi的設計原則,設計與合成靶向RUNX3基因啟動子發(fā)卡樣特異性干擾寡核苷酸序列(short hairpin RNAs,shRNAs);構建特異性真核表達載體pSilencer3.1-H1-

2、shRNA/RUNX3,將重組的真核表達載體轉(zhuǎn)染SGC7901細胞系,經(jīng)G418篩選,RT-PCR、Western blotting及SP免疫細胞化學方法,鑒定與檢測RUNX3基因mRNA及蛋白質(zhì)質(zhì)表達水平的變化,獲得RUNX3基因穩(wěn)定表達沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細胞系;擴大培養(yǎng)陽性細胞克隆,通過繪制RUNX3基因表達沉默的SGC7901細胞系生長曲線、檢測其克隆形成率、分析細胞周期改

3、變,觀察RUNX3基因表達沉默對SGC7901細胞生長增殖的影響,經(jīng)HE染色,觀察細胞形態(tài)改變;然后應用不同濃度的特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-氮雜-2'-脫氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)處理 pSilencer3.1-H1-shRNA/ RUNX3/SGC7901細胞系,運用 RT-PCR和Western blotting方法,檢測RUNX3基因mRNA及蛋白質(zhì)質(zhì)表達水平。
　　

4、結果:
　　重組質(zhì)粒 DNA經(jīng)酶切和測序鑒定,結果均證實 pSilencer3.1-H1-RUNX3-shRNA真核表達載體構建成功。采用 Lipofectamine2000脂質(zhì)體將pSilencer3.1-H1-RUNX3-shRNA和pSilencer3.1-H1空載體分別轉(zhuǎn)染SGC7901細胞,G418篩選,陽性細胞克隆,經(jīng)RT-PCR、Western blotting及SP免疫細胞化學方法,進行鑒定,成功建立RUNX3表達

5、沉默的SGC7901細胞系。繪制細胞生長曲線結果表明: pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901組較轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組,細胞生長增殖速度加快(P<0.05),而轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組生長速度相近(P>0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示:轉(zhuǎn)pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3基因組細胞集落形成率為(17.4±0.31)％,轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組的集落形成率分別為(9.9±0.3)%和(9

6、.7±0.6)%,轉(zhuǎn)基因組細胞集落形成率明顯高于轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。進一步采用流式細胞儀,檢測RUNX3基因表達沉默對SGC7901細胞周期的影響,實驗結果顯示:RUNX3基因表達沉默組與轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組相比較, RUNX3基因表達沉默組細胞群體中,處于G0/G1期細胞比例降低,而S期細胞比例增高,差異具有顯著性意義(P<0.05),而轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組間細胞周期改變差異無顯著性意義(P<

7、0.05)。HE染色,光鏡觀測顯示:三組細胞均為中分化粘液腺癌,其中RUNX3基因表達沉默組細胞核分裂增多,可見多個瘤巨細胞。經(jīng)不同濃度的5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細胞,經(jīng)RT-PCR及Western blotting方法檢測,研究結果顯示,5-Aza-CdR未能恢復RUNX3基因在pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細胞中的表達。<

8、br>　　結論:
　　1.構建pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3真核表達載體,成功建立RUNX3基因表達沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細胞系。
　　2.RUNX3基因在SGC7901細胞系表達沉默,使SGC7901細胞生長增殖速度加快,軟瓊脂克隆形成能力增強,細胞群體中 G0/G1期細胞比例降低,S期細胞比例增高,病理性核分裂像多見,并可見瘤巨細胞。