pEGFP-IRES-BDNF轉染BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩98頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、脊髓損傷(spinal cord injuries,SCI)是現(xiàn)在交通、工礦事故、運動意外以及戰(zhàn)傷中常見的損傷,傷者多為青壯年,損傷造成的截癱不僅嚴重影響患者的身心健康,而且給家庭和社會造成巨大的經濟、人力和精神負擔。長期以來脊髓損傷的修復一直是困擾人類健康的難題,也是世界各國科學家們致力于研究的焦點,但目前缺少切實可行的有效治療方法。 胚胎干細胞、神經干細胞和嗅鞘細胞移植是目前研究的熱點,但是都存在組織來源缺乏、倫理學及免疫排

2、斥等問題,而自體骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植可以解決上述問題。 BMSCs作為一種多潛能干細胞對中樞神經系統(tǒng)損傷或外傷等造成的功能喪失治療作用顯著,具有與其它細胞來源無法比擬的優(yōu)勢:(1)獲取方便,可從患者本人骨髓取材;(2)可在體外快速培養(yǎng)擴增,并定向誘導分化;(3)在宿主組織中可長期生存并進行整合;(4)通過自體移植可避開免疫排斥反應;(5)可進行基因工程技術加工;(6)能以多種途徑包括靜脈注射、中樞神經損傷處不同部位

3、進行細胞移植。因此,BMSCs是一種理想的細胞來源,為神經系統(tǒng)疾病的細胞和基因治療提供了新的思路和廣闊前景。 腦源性神經生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為神經生長因子(NGF)家族的第二個成員。BDNF對多巴胺能神經元、膽堿能神經元等多種神經元都有廣泛作用,能促進干細胞更多的向神經元樣細胞分化。局部注射神經營養(yǎng)因子,有一定的危險性,并且不能長久維持較長時間的高濃度。全身靜脈

4、應用,劑量必然需要大大增加,而中樞神經系統(tǒng)解剖結構的特殊性使外源性給藥利用率不高,同時由于局部微循環(huán)破壞而達不到治療濃度。這就要求采用一種能使神經營養(yǎng)因子長久維持在損傷局部的高濃度釋放的方法。 BDNF基因轉染BMSCs,BMSCs可以反復傳代擴增,分泌大量的神經生長因子,并且誘導BMSCs向神經系細胞分化,從而為脊髓損傷的干細胞移植治療及神經營養(yǎng)因子基因治療探索一種新的切實可行的可能具有突破性的方法。 目的:

5、1、探討密度梯度離心和差速貼壁法對BMSCs的體外分離、純化、培養(yǎng),研究BMSCs的增殖、分化以及免疫學等生物學特性。 2、探索BDNF、GFP共表達質粒的構建與轉染BMSCs方法,以及BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP的生物學特性。 3、探討B(tài)MSCs、BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP與DRG經Transwell共培養(yǎng)的方法,及對DRG軸突生長的促進作用。 4、評價BMSCs-BD

6、NF-GFP移植治療大鼠脊髓損傷的作用。 方法: 第一部分選用6周齡SD大鼠,采用Ficoll分離液密度梯度離心法獲取骨髓中的BMSCs,通過反復傳代培養(yǎng)差速貼壁法使之純化,獲得的細胞純度高,生物性狀穩(wěn)定,增殖能力強的細胞株。并重點地觀察了BMSCs形態(tài)變化、細胞活性、細胞生長曲線、表面免疫標記物檢測以及細胞的成骨誘導分化能力等。 第二部分主要研究從大鼠胎腦組織中獲取BDNF序列,構建BDNF和GFP共表達重組質

7、粒pEGFP-IRES2-BDNF,lipofectamine 2000介導轉染BMSCs,獲得同時穩(wěn)定高效表達BDNF和GFP的BMSCs-BDNF-EGFP。ELISA等方法研究BMSCs-BDNF-EGFP的生物學特性。 第三部分取孕期14d的胎鼠的背根神經節(jié),建立體外胚胎大鼠背根神經節(jié)的分離培養(yǎng)及純化體系,并通過0.40μm的Transwell小室胎鼠行DRG與BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EG

8、FP共培養(yǎng),通過倒置相差顯微鏡及免疫組化觀察其對DRG軸突生長的促進作用,驗證細胞活性。 第四部分動物分組和損傷模型的制備及處理:制備大鼠脊髓半切損傷動物模型,分別行生理鹽水、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP移植。實驗結果的觀測:(1)行為學觀測:BBB評分;(2)動物灌注,脊髓切片;(3)免疫組織化學分析(4)BDA順行追蹤。統(tǒng)計學分析。 結果: 1、密度梯度離心和差速貼壁法分離

9、純化的BMSCs經生物學及流式細胞儀表面標記物鑒定,活細胞率為95~100%,純度99%;誘導培養(yǎng)后堿性磷酸酶染色陽性,鈣結節(jié)染色陽性。 2、成功構建BDNF和GFP共表達質粒,并成功轉染BMSCs,獲得的BMSCs-BDNF-EGFP增強表達BDNF,是正常細胞的20,000倍。 3、胎鼠的DRG通過Transwell培養(yǎng)板與BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP共培養(yǎng),BMSCs、BMSCs

10、-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促進DRG的軸突生長,BMSCs-BDNF-EGFP更明顯。 4、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促進大鼠脊髓損傷的修復,BMSCs-BDNF-EGFP效果更顯著。 結論: 1、密度梯度離心和差速貼壁法是一種很好的分離純化BMSCs的方法。 2、pEGFP-IRES2-BDNF使BDNF和GFP兩個基因在一個載體中的同一個啟動子下協(xié)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論