miRNAlet-7b修飾BMSCs移植對大鼠損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的影響.pdf

1、目的:
　　脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是后果非常嚴(yán)重的脊柱疾病,它導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、功能性運(yùn)動(dòng)和感覺喪失,常會(huì)引起損傷平面以下軀體感覺與功能的嚴(yán)重障礙，喪失生活自理能力。目前，臨床上尚無有效的治療方法。隨著社會(huì)的進(jìn)步和科學(xué)家不懈的探索，外源性干細(xì)胞移植可能為脊髓損傷的治療帶來曙光,而由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）來源廣泛，分離培養(yǎng)方

2、法簡單，有望成為細(xì)胞治療的“種子”。然而在實(shí)驗(yàn)研究中，因?yàn)锽MSCs移植在宿主體內(nèi)的成活及轉(zhuǎn)化問題，其進(jìn)一步應(yīng)用中無法得到開展。miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，具有調(diào)控真核生物基因表達(dá)、個(gè)體發(fā)育和細(xì)胞周期等作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAlet-7b可以調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化、促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新等。但是miRNAlet-7b修飾的BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷的療效，是否比單純的BMSCs移植更好，鮮少有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過Basso Beat

3、tie Bresnahan（BBB）評分評估實(shí)驗(yàn)過程大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，HE染色觀察損傷部位脊髓組織的形態(tài)學(xué)變化，免疫組化SP法觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neurun specific etlolase，NSE)、微管相關(guān)蛋白(Microtubule associated proteins-1β，MAP-1β)、波形蛋白(Vimentin,VIM)的表達(dá),Rt-PCR檢測脊髓損傷區(qū)NGF mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究miRNAlet-7b

4、修飾BMSCs移植對大鼠損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　分離培養(yǎng) BMSCs并構(gòu)建 miRNA-let7b慢病毒載體。按照隨機(jī)數(shù)字表法選取60只健康雌性SD大鼠分為3組：對照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。采用改良 Allen’s法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。脊髓損傷后1周，miRNA組大鼠移植10μL miRNA-let7b慢病毒載體感染的BMSCs（細(xì)胞濃度為10^7/ml），BMSCs組

5、移植等量陰性慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSCs，對照組給予損傷部位等量生理鹽水。分別在脊髓損傷后的第1、2、4、8周對大鼠后肢進(jìn)行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分，評價(jià)脊髓損傷后大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。于脊髓損傷后第4周，HE染色觀察損傷部位脊髓組織的形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關(guān)蛋白(MAP-1β)、波形蛋白(VIM)的表達(dá)、Rt-PCR法檢測脊髓損傷區(qū)NGF mRNA的表達(dá)

6、情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析。如果方差齊，組間比較采用t檢驗(yàn)；不齊，則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1、BBB評分結(jié)果：建模3天前評分均為21分，建模成功后評分均低于8分，結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1周后3組大鼠出現(xiàn)雙下肢運(yùn)動(dòng)功能不同程度的改善，不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠BBB評分由低到高依次為對照組、BMSCs組、miRN

7、A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、HE染色結(jié)果：3組大鼠脊髓組織可見結(jié)構(gòu)紊亂充血，神經(jīng)細(xì)胞水腫，對照組結(jié)構(gòu)病理學(xué)改變嚴(yán)重，miRNA組和BMSCs組較輕。
　　3、免疫組化結(jié)果：3組脊髓損傷標(biāo)本均見NSE、MAP-1β、VIM陽性表達(dá)。半定量分析法顯示神經(jīng)特異性標(biāo)志物 NSE、MAP-1β、VIM在 miRNA組表現(xiàn)為陽性細(xì)胞的數(shù)目較多、包漿呈棟褐色,陽性表達(dá)明顯高于其他各組，差異具有顯著意義。干細(xì)胞移植組

8、陽性表達(dá)高于對照組(P<0.05)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4、PCR結(jié)果顯示：脊髓組織中NGF mRNA表達(dá)水平由低到高依次為對照組、BMSCs組、miRNA組，且各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、miRNA Let-7b修飾的BMSCs可促進(jìn)損傷脊髓NSE、MAP-1β、VIM的表達(dá)，并促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，效果優(yōu)于單純干細(xì)胞移植組。
　　2、m