川崎病血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡和趨化因子及其受體表達的影響.pdf

1、目的:
　　通過觀察川崎病患兒急性期血清、恢復(fù)期血清和正常兒童血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡和趨化因子及其受體表達的影響，探討川崎病血清和趨化因子在川崎病患兒冠狀動脈損傷中的作用及其可能的機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)HUVECs。
　　2.血清制備分別采集5例在我院明確診斷為典型川崎病患兒急性期（發(fā)熱7d內(nèi)）、靜脈丙種球蛋白治療后（川崎病恢復(fù)期）及本院門診體檢、年齡相仿的正常健康兒童靜脈血各4 mL

2、。4℃4000轉(zhuǎn)/min離心15min，-80℃凍存待用。實驗前將血清置于4℃解凍，分組合并為川崎病急性期血清組、恢復(fù)期組及正常兒童血清組，所有血清使用0.22μm微孔濾器過濾后除菌。
　　3.實驗分組用含10％的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640正常培養(yǎng)HUVECs，根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為4組:(1)川崎病急性期血清組(KD1):HUVECs+川崎病急性期血清+ RPMI-1640培養(yǎng)基;(2)川崎病恢復(fù)期（丙種球蛋白治療后）

3、血清組(KD2):HUVECs+川崎病恢復(fù)期血清+RPMI-1640培養(yǎng)基;(3)正常血清組(N):HUVECs+正常兒童血清+RPMI-1640培養(yǎng)基(4)空白對照組(Con):HUVECs+ RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　4.細胞增殖與凋亡的檢測 CCK-8和流式細胞術(shù)分別檢測各組血清對內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響。
　　5.凋亡相關(guān)蛋白檢測各組干預(yù)因素加入細胞24h后應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)檢測各組H

4、UVECs中凋亡相關(guān)基因Caspase-3蛋白的表達情況。
　　6.趨化因子及其受體基因表達水平的檢測各組干預(yù)因素加入細胞后24h后應(yīng)用qPCR熒光定量技術(shù)檢測各組細胞內(nèi)趨化因子及其受體mRNA表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用CCK-8法測定各組血清對HUVECs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)KD1組、KD2和N組的OD值分別為（0.64±0.10、0.81±0.06、0.92±0.08），計算各組抑制率，差異均具有統(tǒng)計學意義(

5、P＜0.05)。
　　2.應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測KD1、KD2和N組的細胞總凋亡率，發(fā)現(xiàn)各組的凋亡率相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.含血清濃度為10％的各組誘導(dǎo)HUVECs時，KD1組和KD2組與N組相比，Caspase-3蛋白表達明顯增多(P＜0.05);而且KD2和N組比亦具有顯著性的差異(P＜0.05)。
　　4.趨化因子及其受體mRNA檢測結(jié)果:與KD1組相比，KD2組和N組的ADAM17 mR