真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA，pVAX1-GC和pVAX1-SG的構(gòu)建及真核表達(dá).pdf

1、齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，在人類其主要的致齲菌是變形鏈球菌群(mutans streptococci group)中的變形鏈球菌(S. mutans)和茸毛鏈球菌(S.sobrinus或稱遠(yuǎn)緣鏈球菌)。粘附是變形鏈球菌致齲的首要條件，變形鏈球菌表面蛋白(surface protein antigen，SpaP)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucocyltransferases，GTFs)介導(dǎo)其對牙面的蔗糖依賴性粘附和蔗糖非依賴性粘附，是菌體表面重

2、要粘附毒力因子，且具有良好的免疫原性和反應(yīng)性，其編碼基因分別為spap、gtf。 本實驗旨在構(gòu)建含有血清c型變形鏈球菌表面蛋白A區(qū)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)CAT編碼基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA、pVAX1-GC和pVAX1-SG，為下一步用微球包裹口服多價防齲核酸疫苗的動物實驗和臨床實驗提供實驗基礎(chǔ)和物質(zhì)條件。 方法：本研究共分為三個實驗 實驗一將變形鏈球菌表面蛋白A區(qū)編碼基因spap/A克隆到真核表達(dá)載體

3、pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA。同時對其進(jìn)行測序分析和酶切鑒定；并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS7中以間接ELISA法和SABC法初步檢測pVAX1-SA的蛋白表達(dá)。 實驗二將變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性區(qū)(CAT)編碼基因gtfB/CAT克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-GC。同時對其進(jìn)行測序分析和酶切鑒定；并通過SABC法初步檢測其蛋白表達(dá)。 實驗三在上述實驗的基礎(chǔ)上，將兩個目的基因

4、片段克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SG經(jīng)測序和酶切鑒定后，通過間接ELISA法和SABC法初步檢測該重組質(zhì)粒能夠正確表達(dá)融合蛋白。 結(jié)果： (1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1-SA測序分析其閱讀碼框架未發(fā)生改變，經(jīng)HindⅢ/Xho Ⅰ雙酶切后可獲得3.0kb和1.32kb大小的片斷，分別與載體pVAX1與目的基因spap/A的大小一致，證實pVAX1-SA構(gòu)建成功；間接ELISA法和SABC法

5、初步證明其能正確表達(dá)目的蛋白。 (2)重組質(zhì)粒pVAX1-GC測序分析其閱讀碼框架未發(fā)生改變，經(jīng)Kpn I/EcoRⅠ雙酶切后可獲得3.0kb和0.53kb大小的片斷，分別與載體pVAX1和目的基因gtfB/CAT的大小相一致，表明pVAX1-GC構(gòu)建成功; SABC法初步證明其蛋白表達(dá)正確。 (3)重組質(zhì)粒pVAX1-SG通過基因測序和HindⅢ、BamHⅠ和EcoR Ⅰ限制內(nèi)切酶酶切鑒定證實融合基因片段插入方向和位置