牛瑟氏泰勒蟲(chóng)pVAX1-2p33真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫學(xué)初步研究.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲(chóng)（Theileria sergenti）寄生于牛的紅細(xì)胞內(nèi)而引起的一種以高熱、貧血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀的一種血液原蟲(chóng)病。在我國(guó)該病的流行區(qū)域逐年擴(kuò)大，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的危害較為嚴(yán)重，已經(jīng)引起獸醫(yī)界的普遍重視。
　　牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的抗原成分較為復(fù)雜，主要有p23、p32、p33表面蛋白等。p33表面蛋白作為一種紅細(xì)胞感染階的膜內(nèi)蛋白，免疫原性較好，在抗牛瑟氏泰

2、勒蟲(chóng)感染中具有重要作用。
　　本研究根據(jù)已報(bào)道的瑟氏泰勒蟲(chóng) p33表面蛋白的基因序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性的引物，以牛瑟氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA為模版，克隆出兩個(gè)大小為723 bp的p33基因。應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)獲得大小約為1422 bp的雙拷貝p33基因，并將該雙拷貝p33基因先克隆到pMD18-T-Simple載體，再將其亞克隆到 pVAX1真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pVAX1-2p33。對(duì)重組質(zhì)粒pVAX1-2p33采用

3、PCR、酶切及測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)染其到BHK-21細(xì)胞后進(jìn)行RT-PCR和IFA鑒定，經(jīng)鑒定正確后，采用質(zhì)粒大量提取試劑盒大量提取重組質(zhì)粒 pVAX1-2p33，并將該質(zhì)粒腿部肌肉注射免疫小鼠，應(yīng)用間接 ELISA和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)雙拷貝的pVAX1-2p33質(zhì)粒的免疫效果進(jìn)行檢測(cè)。間接 ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同免疫劑量下，重組質(zhì)粒pVAX1-2p33免疫組在免疫后的地14 d可刺激免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗體，但

4、抗體水平較低，上升趨勢(shì)不明顯。但在免疫后的第28 d后抗體呈明顯的上升趨勢(shì)，且42 d時(shí)到達(dá)頂峰，而且pVAX1-2p33免疫組的抗體效價(jià)明顯高于pVAX1-p33免疫組(P<0.01)，表明2p33的體液免疫水平顯著高于p33。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pVAX1-2p33、pVAX1-p33均能使CD4+、CD8+上升，刺激小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫效果，但二者總體的細(xì)胞免疫水平差別不顯著（P>0.05)。
　　本結(jié)果將為牛瑟氏泰勒