Vasohibin1對結(jié)腸癌血管生成調(diào)控和腫瘤細(xì)胞抑制功能的臨床和分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，在美國每年大約有100，000新增病例、50，000死亡病例，在我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的10％-15％。結(jié)腸癌的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療等，結(jié)腸癌經(jīng)過根治性切除術(shù)和輔助化療，在5年內(nèi)仍有較高的復(fù)發(fā)率。研究表明，腫瘤的血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。腫瘤血管生成是一種動(dòng)態(tài)過程，是血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子相互作用的結(jié)果。
　　

2、Vasohibin1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的血管抑制因子。Vasohibin(VASH)家族包括VASH1和VASH2。VASH1由VEGF-A和FGF-2刺激產(chǎn)生，并選擇性的表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VASH1有兩個(gè)亞型VASH1-A和VASH1-B。VASH1的同源異構(gòu)體VASH2主要表達(dá)于單核細(xì)胞。VASH1多表達(dá)在血管內(nèi)皮生成的終末區(qū)，抑制新生血管形成。VASH2多表達(dá)在血管內(nèi)皮生成的起始端，促進(jìn)血管形成。VASH1作為血管生成抑制劑在腫

3、瘤血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)VASH1在乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、肺癌等癌組織的血管內(nèi)皮中高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但在結(jié)腸癌中尚未有相關(guān)研究。此外VASH1不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮，近年研究發(fā)現(xiàn)VASH1還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。但其具體的生物學(xué)功能，尤其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展方面的功能，尚不清楚。
　　基于以上研究背景，本課題主要通過分析VASH1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，回顧性分析腫瘤血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞中VASH1的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞中VASH1的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性;使用VASH1-A和VASH1-B的過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29，使用shRNA干擾、沉默結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中VASH1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過以上途徑，研究VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞生長、粘附、遷移等生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，探討VASH1通過激活、參與細(xì)胞的凋亡、衰老，發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用;使用皮下移植瘤模型和腫瘤轉(zhuǎn)移模型，進(jìn)一步驗(yàn)證VASH1

5、對結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制，為結(jié)腸癌靶向治療，開辟新的方向和途徑。
　　方法:
　　1.VASH1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義:選取山東省濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科存檔且臨床病理資料完整的75例結(jié)腸癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測在結(jié)腸癌組織中，VASH1在血管內(nèi)皮的表達(dá)、VEGF-A、VEGF-C的表達(dá)，以及腫瘤微血管密度（MVD，CD34標(biāo)記）、腫瘤微淋巴管密度（LVD，D2-40標(biāo)記），分析血

6、管內(nèi)皮表達(dá)VASH1與VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40表達(dá)的相關(guān)性，及其與結(jié)腸癌相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測VASH1在結(jié)腸癌組織中腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，分析結(jié)腸癌組織中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)VASH1與結(jié)腸癌相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。
　　3.使用Real Time PCR和Weastern Blot方法，檢測VASH1在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，篩選VASH1的高表達(dá)細(xì)胞系和低表達(dá)細(xì)胞

7、系。
　　4.選用VASH1低表達(dá)細(xì)胞系HT29，轉(zhuǎn)染、過表達(dá)VASH1-A和VASH1-B，通過繪制生長曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)，檢測VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增值的影響;通過SA-β-gal染色和流式細(xì)胞術(shù)，檢測VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞衰老和凋亡的影響。
　　5.VASH1過表達(dá)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過小管形成實(shí)驗(yàn)，檢測其對血管形成的影響。
　　6.VASH1敲除對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:sh

8、RNA轉(zhuǎn)染VASH1高表達(dá)細(xì)胞系HCT116，敲除、沉默VASH1的表達(dá)。通過生長曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)，研究VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增值的影響。應(yīng)用粘附實(shí)驗(yàn)檢測VASH1對腫瘤細(xì)胞粘附能力的影響。通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測VASH1對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。
　　7.VASH1過表達(dá)移植瘤模型建立:裸鼠皮下注射過表達(dá)VASH1-A、VASH1-B及空載體的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞(5×106)。

9、注射后每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，繪制移植瘤生長曲線。腫瘤超過2cm處死小鼠，取出腫瘤組織并稱重。移植瘤組織免疫組化檢測KI-67、Cleaved Caspase-3及CD34，研究VASH1在體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增值、凋亡及血管生成的影響;移植瘤組織SA-β-gal染色，檢測VASH1在體內(nèi)對組織衰老機(jī)制的影響。
　　8.VASH1沉默移植瘤模型建立:Rag1-/-小鼠皮下注射轉(zhuǎn)染shRNA及ControlshRNA的HC

10、T116(4×106)。其余方法同步驟6。
　　9.轉(zhuǎn)移瘤模型建立:尾靜脈注射法將轉(zhuǎn)染shRNA及Control shRNA的HCT116(2×106)注射到Rag1-/-小鼠體內(nèi)。注射6周后處死小鼠，取肺、肝組織，解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移灶。使用OCT包埋組織速凍后，切片HE染色驗(yàn)證轉(zhuǎn)移灶。
　　結(jié)果:
　　1.VASH1蛋白在結(jié)腸癌組織間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而不表達(dá)于間質(zhì)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。過表達(dá)VASH1-A或VA

11、SH1-B的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可形成不完整的管狀結(jié)構(gòu)，且其分支點(diǎn)數(shù)低于空白載體組，差異有顯著性(p≤0.01)。VASH1在結(jié)腸癌組織間質(zhì)的表達(dá)明顯高于癌旁組織(p＜0.01)，兩者呈正相關(guān)(p=0.004)。VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)，均高于癌旁組織(p＜0.01)。結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)VASH1的表達(dá)與MVD表達(dá)呈正相關(guān)，與VEGF-A、VEGF-C、LVD無相關(guān)性。結(jié)腸癌腫瘤間質(zhì)VASH1的

12、表達(dá)與腫瘤體積(p=0.021124)、腫瘤臨床分期(p=0.0069078)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p=0.0031225)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.VASH1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義:免疫組化檢測結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織切片中，VASH1也腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(p=0.01613)。
　　3.VASH1在腫瘤細(xì)胞系的表達(dá):Real Time PCR檢測VASH1-A、VASH1-B在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。VASH1-A在所

13、檢測的腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，其中乳腺癌MCF7表達(dá)最高。結(jié)腸癌細(xì)胞系中HT29表達(dá)最低，HCT116表達(dá)最高。VASH1-B在所檢測的腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，其中乳腺癌MCF7表達(dá)最高。結(jié)腸癌細(xì)胞系中HT29表達(dá)最低，HCT116表達(dá)最高。
　　4.過表達(dá)VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:通過生長曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)，檢測過表達(dá)VASH1-A、B基因后對HT29細(xì)胞生長、增殖的影響。與對照組相比，VASH1

14、過表達(dá)組細(xì)胞的生長、增殖及克隆形成能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，提示過表達(dá)VASH1-A、B基因抑制HT29細(xì)胞增殖，使其生長速度減緩，克隆形成能力降低;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示過表達(dá)VASH1-B促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(p＜0.01)。SA-β-gal染色結(jié)果提示過表達(dá)VASH1-A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老(p＜0.01)。
　　5.敲除VASH1對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:通過生長曲線、3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)，

15、檢測沉默VASH1基因后HCT116細(xì)胞的增殖情況。與對照組相比，shRNA干擾組細(xì)胞的增殖速度顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，shRNA干擾、沉默VASH1顯著提高HCT116細(xì)胞的粘附能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA干擾、沉默VASH1顯著增強(qiáng)HCT116細(xì)胞的遷移能力(p＜0.05)。
　　6.通過HT29細(xì)胞裸鼠皮下移植模型，觀察VASH1在體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響

16、:腫瘤體積曲線顯示，VASH1-A、VASH1-B過表達(dá)組腫瘤生長速度顯著低于空載體對照組(p=0.025)。檢測腫瘤重量提示，空載體對照組腫瘤重量明顯高于VASH1-A、VASH1-B過表達(dá)組(p＜0.01)。免疫組合檢測顯示，VASH1-A、VASH1-B過表達(dá)組，腫瘤組織KI-67的表達(dá)小于空載體對照組(p＜0.05);VASH1-B過表達(dá)組，腫瘤組織Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著高于空載體對照組(p＜0.01);腫

17、瘤組織表達(dá)的CD34在三組間無明顯差異。SA-β-gal染色結(jié)果顯示，VASH1-A過表達(dá)組，陽性細(xì)胞高于空載體對照組(p＜0.05)。
　　7.通過HCT116細(xì)胞Rag1-/-小鼠皮下移植模型，觀察VASH1在體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響:腫瘤體積曲線顯示，shRNA沉默組腫瘤生長速度顯著快于control shRNA組(p＜0.01)。腫瘤重量結(jié)果顯示，shRNA沉默組腫瘤重量大于control shRNA組(p＜0.05)。

18、免疫組化結(jié)果提示，shRNA沉默組KI-67表達(dá)高于control shRNA組。
　　8.通過HCT116細(xì)胞Rag1-/-小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察VASH1對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響:成模后6周取肺、肝組織，計(jì)數(shù)表面腫瘤表面轉(zhuǎn)移灶。切片HE染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果提示，shRNA沉默組肺組織的腫瘤轉(zhuǎn)移灶(p＜0.05)及肝組織的腫瘤轉(zhuǎn)移灶(p＜0.01)明顯高于control shRNA組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:

19、　　1.VASH1表達(dá)于結(jié)腸癌間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管生成并與腫瘤體積、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。
　　2.VASH1表達(dá)于結(jié)腸癌組織的腫瘤細(xì)胞，與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。提示腫瘤細(xì)胞表達(dá)的VASH1，與血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的VASH1功能不同。
　　3.誘導(dǎo)VASH1在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)、沉默，證實(shí)VASH1可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、增值、粘附及遷移。
　　4.VASH1-A參與誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老;VASH1-B