應(yīng)用siRNA敲低MMP-9基因表達(dá)后對(duì)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用的體內(nèi)外研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，由于呈侵襲性生長(zhǎng)，增殖速度快，現(xiàn)有的綜合治療措施如外科手術(shù)切除、術(shù)后放療、化療和免疫治療難以達(dá)到根除，復(fù)發(fā)率很高，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量和生存期，其臨床預(yù)后甚差。隨著腫瘤生物學(xué)和分子遺傳學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，目前已認(rèn)識(shí)到，膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病，和人體其他部位的腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展主要是原癌基因的激活與抑癌基因的失活并由此產(chǎn)生一系列基因異常和動(dòng)態(tài)演進(jìn)的結(jié)果，因此尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因，深入了

2、解膠質(zhì)瘤的分子病理，在此基礎(chǔ)上開拓膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點(diǎn)，成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容；由此，糾正與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的基因治療也成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿課題，為國(guó)內(nèi)外膠質(zhì)瘤研究熱點(diǎn)之一。 本課題重點(diǎn)研究了膠質(zhì)瘤中MMP-9的異常表達(dá)以及應(yīng)用RNA干涉技術(shù)干預(yù)MMP-9在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤惡性表型的影響。課題分三部分進(jìn)行： 第一部分中應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法以49例膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本和4例正常腦組織為研究對(duì)

3、象，對(duì)MMP-9蛋白異常表達(dá)情況進(jìn)行初步篩選和驗(yàn)證，觀察MMP-9蛋白在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤表達(dá)情況，探討MMP-9異常表達(dá)與腫瘤惡性程度之間的關(guān)系，研究MMP-9表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤侵襲的相關(guān)性。 第二部分則側(cè)重于在體外應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以oligofectamine介導(dǎo)MMP-9 siRNA靶向轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系后，應(yīng)用PCR檢測(cè)目的基因的敲低情況，并用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了RNAi敲低MMP-9

4、的表達(dá)后，MMP-9蛋白的表達(dá)變化。并用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT、流式細(xì)胞術(shù)及Matrigel 2D、3D生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等方法分析了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布和侵襲能力的變化。 第三部分中則通過建立裸鼠膠質(zhì)瘤皮下動(dòng)物模型，在荷瘤裸鼠瘤內(nèi)注射oligofectamine和MMP-9siRNA的混合物，動(dòng)態(tài)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染MMP-9siRNA后腫瘤生長(zhǎng)情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RNA干涉技術(shù)敲低U251裸鼠膠質(zhì)

5、瘤MMP-9基因的表達(dá)后該蛋白的表達(dá)變化，對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果: 第一部分 MMP-9在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)增高，且隨腫瘤惡性程度的升高其表達(dá)豐度呈現(xiàn)上升現(xiàn)象，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率與膠質(zhì)瘤惡性程度成正相關(guān)。 第二部分半定量PCR以及Western blotting檢測(cè)顯示應(yīng)用RNA干擾技術(shù)以MMP-9siRNA敲低人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251中MMP-9基因表達(dá)后，MMP-9的mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白

6、水平的表達(dá)均得到顯著抑制。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力顯示轉(zhuǎn)染MMP-9siRNA組的U251細(xì)胞增殖能力明顯下降；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示MMP-9基因表達(dá)被抑制后，U251細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制，出現(xiàn)G0/G1阻滯；2D、3D生長(zhǎng)試驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染MMP-9siRNA后U251細(xì)胞水解模擬基質(zhì)膠能力明顯下降，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)能力受到抑制，其體外侵襲能力與對(duì)照組相比明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

7、.001)。 第三部分以瘤組織塊接種法成功建立U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系裸鼠皮下腫瘤模型，每4天測(cè)量一次腫瘤體積，并在腫瘤局部多點(diǎn)注射MMP-9siRNA和oligofectamine混合物進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，MMP-9 siRNA治療組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，從治療后的第4天起，腫瘤體積出現(xiàn)明顯差別，這種差別在觀察末期(28天)最顯著，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；對(duì)照組和nonsene siRNA轉(zhuǎn)染組部分動(dòng)物腫瘤

8、有明顯的出血，液化和壞死，符合惡性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)，而MMP-9 siRNA治療組腫瘤均為實(shí)體性，無明顯液化，局部區(qū)域有零星壞死灶。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組MMP-9的蛋白表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。 結(jié)論: 1.膠質(zhì)瘤中MMP-9的過表達(dá)與細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤中隨著MMP-9表達(dá)增高呈現(xiàn)惡性程度增高的現(xiàn)象。 2.應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以O(shè)ligof

9、ectamine介導(dǎo)靶向轉(zhuǎn)染MMP-9siRNA可有效敲低這個(gè)基因在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)，降低MMP-9蛋白酶的活性，從而抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲，出現(xiàn)G0/G1期阻滯。 3.裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型應(yīng)用Oligofectamine介導(dǎo)的MMP-9siRNA治療，同樣可有效敲低MMP-9的表達(dá)，抑制MMP-9的活性，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲，與體外試驗(yàn)結(jié)果一致。 4.MMP-9可成為基因治療的侯選基因，RNA干涉