WDR26對氧化應激所致心肌細胞mPTP開放的影響及其心肌保護作用研究.pdf

1、在缺血的基礎上恢復血流灌注后，心肌組織損傷反而加重的現(xiàn)象稱為心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）。心肌缺血再-灌注損傷常見于冠狀動脈搭橋術、心血管栓塞再通、體外循環(huán)下行心肺直視手術等。其發(fā)生機制與活性氧的產(chǎn)生、鈣超載、微血管損傷和能量代謝障礙等有關。過氧化氫，超氧陰離子和羥自由基等活性氧在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。
　　 WD重復序列是一段包括

2、在甘氨酸-組氨酸(GH)二肽和色氨酸-天門冬氨酸(WD)二肽之間的含有40個左右氨基酸的保守氨基酸片段。這些重復序列可以形成的蛋白結構域被稱為WD區(qū)域。WDR蛋白家族是包含4～16個WD重復序列的廣泛存在于真核生物的一組蛋白。WDR蛋白有著廣泛的功能。這些功能包括信號轉導、基因轉錄調控、細胞周期控制、自噬與細胞凋亡等，主要通過形成多蛋白復合物來實現(xiàn)，而且與許多疾病具有密切關系。WDR26(WD repeatdomain26)基因是本實驗

3、室研究人員采用生物信息學技術和5’-RACE技術相結合的方法，從大鼠心肌組織中首次克隆的一個在缺血預適應中表達上調的新基因，最初命名為Mipu2(myocardialischemic preconditioning upregulated protein2)。作為一個在心肌缺血預適應中表達升高的蛋白，是否對心肌缺血-再灌注損傷發(fā)揮保護作用，目前尚不清楚。
　　 為了觀察WDR26的表達模式，本實驗分別采用大鼠心肌缺血-再灌損傷和

4、H9c2心肌細胞氧化應激模型。利用real-time PCR和Western-blot分別檢測WDR26的mRNA和蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn)，心肌缺血-再灌注損傷中WDR26的mRNA和蛋白水平在缺血再灌注lh和2h后明顯增高。H9c2細胞暴露于過氧化氫后，WDR26的mRNA和蛋白水平在2h和4h后明顯增高。以上結果表明:心肌缺血-再灌損傷和心肌細胞氧化應激損傷可以使WDR26表達增高。
　　 隨后利用Westem-blot和激光

5、共聚焦顯微鏡檢測了WDR26的亞細胞定位。Western-blot結果顯示W(wǎng)DR26蛋白在線粒體中表達。H9c2心肌細胞瞬時轉染W(wǎng)DR26基因后，利用線粒體標記探針Mito-tracker標記線粒體，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)WDR26和線粒體標記存在共定位。這些結果表明，WDR26蛋白定位于線粒體。
　　 為進一步探討WDR26對心肌損傷的保護作用及其機制，采用WDR26過表達和表達抑制策略觀察了WDR26對過氧化氫所致H9c2心

6、肌細胞損傷的影響。結果發(fā)現(xiàn)，WDR26過表達可明顯抑制過氧化氫引起的心肌細胞壞死和凋亡，WDR26抑制表達后可加重這種損傷作用。此外WDR26過表達可明顯抑制過氧化氫引起的Caspase-3和Caspase9活性增加，并且可抑制細胞色素C從線粒體釋放到胞漿。以上結果表明: WDR26可抑制過氧化氫引起的心肌細胞壞死和凋亡，其抗凋亡作用可能主要通過抑制線粒體凋亡途徑來實現(xiàn)。
　　 由于WDR蛋白主要通過和其它蛋白相互作用來發(fā)揮其功

7、能，本研究采用免疫沉淀和蛋白質質譜分析對WDR26相互作用蛋白進行篩選。結果發(fā)現(xiàn)有47個蛋白可能與WDR26相互作用。前文證實WDR26能抵抗過氧化氫所致的心肌細胞凋亡，但機制不明。鑒于線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放在細胞凋亡發(fā)生中的作用，本研究采用免疫共沉淀技術進一步探討WDR26與細胞凋亡密切相關的MPTP——蛋白電位依賴性陰離子選擇性通道(

8、voltage-dependent anion channel protein，VDAC)和腺苷酸轉位子(adenine nucleotide translocator，ANT)的相互作用。結果發(fā)現(xiàn)，WDR26與電VDAC和ANT具有相互作用。
　　 為進一步研究WDR26對線粒體膜通透性轉換孔開放的影響，本研究采用WDR26過表達的H9c2心肌細胞，經(jīng)過氧化氫處理后觀察細胞線粒體膜電位的變化，并分離上述細胞的線粒體，經(jīng)鈣離子刺

9、激后檢測線粒體的腫脹。結果表明WDR26過表達可以明顯抑制過氧化氫引起的心肌細胞線粒體膜電位下降和鈣離子引起的線粒體腫脹。
　　 綜上所述，WDR26作為一個在心肌中新發(fā)現(xiàn)的蛋白，對心肌缺血-再灌注損傷和心肌氧化應激損傷發(fā)揮重要的保護作用。心肌缺血-再灌損傷及氧化應激損傷中WDR26的表達明顯增加。WDR26通過與線粒體膜通透性轉換孔蛋白VDAC和ANT發(fā)生相互作用，抑制線粒體通透性轉換孔的開放和線粒體凋亡信號轉導通路的激活，從