已酮可可堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛及其相關(guān)細(xì)胞因子的影響.pdf

1、本文擬在坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎所致神經(jīng)病理性疼痛模型上通過全身給藥，觀察已酮可可堿是否對(duì)神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用；在此基礎(chǔ)上，采用熒光定量PCR技術(shù)(FQ-RT-PCR)和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分別動(dòng)態(tài)檢測(cè)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(ehronic constrietion injury CCI)后大鼠脊髓中TNFα、IL-1β、IL-6mRNA和蛋白的表達(dá)變化，并探討其在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的意義。同時(shí)觀察已酮可可堿對(duì)脊髓中

2、上述細(xì)胞因子的影響，探討已酮可可堿的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 論文一：已酮可可堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的作用。 實(shí)驗(yàn)材料: 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用。健康成年雄性Sprague Dawley大鼠，實(shí)驗(yàn)前體重250±20g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2、主要試劑和藥品。已酮可可堿(石家莊制藥廠，批號(hào)：0504009-P6001)。 3、主要儀器Von Frey細(xì)絲(Stoleting公司，美國(guó))

3、；BME-410A型熱痛刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，中國(guó))； 實(shí)驗(yàn)方法： 1、慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(Chronic Constriction Injury,CCI)模型的制作。戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射后，選擇左側(cè)后肢，暴露坐骨神經(jīng)，以3.0絲線相隔lmm松結(jié)扎4道，至神經(jīng)外膜稍稍受壓為止，逐層縫合。假手術(shù)組步驟與神經(jīng)結(jié)扎組大鼠相同，但僅進(jìn)行分離坐骨神經(jīng)手術(shù)操作，不結(jié)扎坐骨神經(jīng)。 2、動(dòng)物分組。

4、 動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、神經(jīng)結(jié)扎組(CCI組)和已酮可可堿組(PTX組)(n=8)，CCI組如上所述進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎；Sham組手術(shù)步驟與CCI組相同，但僅暴露坐骨神經(jīng)并游離連接組織，而不行坐骨神經(jīng)結(jié)扎；PTX組進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，并于術(shù)前1天開始至取材點(diǎn)每天腹腔注射PTX100mg·kg<'-1>，CCI組和Sham組腹腔注射相同容積的生理鹽水。各組分別于手術(shù)后1，3，7，11，14，21天觀察機(jī)械縮足反射閾值

5、(Mechanical Withdrawal Threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎對(duì)大鼠同側(cè)后足熱縮足反射潛伏期(TWL)的影響。各組間MWT基礎(chǔ)值無顯著性差異。坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后1天，CCI組大鼠MWT即顯著降低，低于術(shù)前的基礎(chǔ)值(P<0.01)，與sham組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。CCI后1天、3天

6、、7天、11天、14天、21天大鼠的MwT與其自身基礎(chǔ)值相比分別降低81.5％，82.2％，84.7％，76.6％，73.4％和70.2％；與術(shù)前及sham組比較，CCI組大鼠MWT持續(xù)降低至術(shù)后21天(P<0.01)。 2、左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎對(duì)大鼠同側(cè)后足熱縮足反射潛伏期(TWL)的影響。各組間TWL基礎(chǔ)值無顯著性差異。坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后第1天，CCI組．大鼠TwL即顯著降低，并且低于術(shù)前的基礎(chǔ)值(P<0.05)，與sham組比較

7、也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。CCI后1天、3天、7天、11天、14天、21天大鼠的TWL與其自身基礎(chǔ)值相比分別降低33.5％，47.8％，45.6％，46.7％，44.5％和40.7％；與術(shù)前及sham組比較，CCI組大鼠TWL持續(xù)降低至術(shù)后21天(P<0.05)。 論文二：已酮可可堿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)細(xì)胞因子的影響。 第一部分、已酮可可堿對(duì)大鼠脊髓TNFα、IL-1β、IL-6蛋白含量的影響。 實(shí)驗(yàn)材料：

8、 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同論文一。 2、主要試劑和藥品TNFα、IL-1 β、IL-6 ELISA試劑盒(北京中杉公司)； 3、主要儀器 恒溫箱(蘇州醫(yī)療設(shè)備廠)；移液器(Gilson公司)；電子天平(Denver InstrumentCompany A-200型，DS美國(guó))；高速離心機(jī)(CS-15R，美國(guó)Beckman)；酶標(biāo)儀(Mode1550，美國(guó)BIO-RAD公司)； 實(shí)驗(yàn)方法 1、CCI動(dòng)

9、物模型制作同論文一。 2、實(shí)驗(yàn)分組。 90只大鼠隨機(jī)分為sham組、CCI組和PTX組。各組又根據(jù)存活的時(shí)間不同分為5個(gè)亞組(n=6)，分別在術(shù)前、術(shù)后1天、7天、14天和21天處死大鼠，取腰段脊髓。 3、ELISA檢測(cè)按照試劑盒說明書操作。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、PTX對(duì)CCI大鼠脊髓TNFα蛋白含量影響。與sham組比較，CCI組術(shù)后1d、7d和14d脊髓中TNFα蛋白含量明顯升高(P<0.05)，

10、其中術(shù)后7d時(shí)TNFα蛋白含量最高(P<0.01)。CCI組術(shù)后1d，7d，14d時(shí)的TNFα蛋白含量分別為sham組的3.44，5.26，30.29倍。PTX組脊髓中TNFα蛋白含量在術(shù)后1d，7d和14d時(shí)明顯降低(P<0.01)，分別為CCI組的48％，49％，52％。術(shù)后21d時(shí)，三組間脊髓中TNFα蛋白含量無明顯差別(P>0.05)。 2、PTX對(duì)CCI大鼠脊髓IL-1β蛋白含量影響。與sham組比較，CCI組IL-1

11、 β蛋白含量于術(shù)后1天開始升高，持續(xù)至術(shù)后14天(P<0.01)。CCI組術(shù)后1d，7d，14d時(shí)的IL-1 β蛋白含量分別為sham組的2.98，3.16，2.95倍。與CCI組比較，PTX組各時(shí)點(diǎn)IL-1 β蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。PTX組術(shù)后1d，7d，14d時(shí)的lL-1 β蛋白含量分別為CCI組的57％，51％，64％。術(shù)后21d時(shí)，三組間脊髓中IL-1 β蛋白含量無明顯差別(P>0.05)。

12、第二部分、熒光定量RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)變化及已酮可可堿對(duì)其的影響。 實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一部分。 2、主要試劑和藥品。DEPC(Sigma公司，美國(guó))；Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))；氯仿；異丙醇；75％酒精，用DEPC處理水配制；RNase-free水，用0.01％DEPC處理過夜、消毒；SupperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑

13、盒(Invitrogen公司，美國(guó))；Taq DNA聚合酶(上海申能公司)；引物和Taqman探針(上海生工生物公司合成)；Q-PCR buffer(美國(guó)ABI公司)；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。 3、主要儀器。 Perkin Elmer 9600 PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmer公司，美國(guó))；AB17000熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Band公司)；高速離心機(jī)(CS-15R，美國(guó)Be

14、ckman)；AIRTECH超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、動(dòng)物模型制作和行為學(xué)觀察同論文一。 2、動(dòng)物分組同第一部分。 3、Trizol法提取大鼠脊髓組織總RNA，RNA濃度和純度鑒定；cDNA合成。 4、TNFα、IL-1β、IL-6引物和熒光探針設(shè)計(jì)、合成及熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)變化和PTX對(duì)其影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

15、 1、內(nèi)參基因GAPDH和目的基因TNFα、IL-1β、IL-6的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值與起始模板數(shù)之間呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.986，0.996，0.997，0.993，證實(shí)了用Ct值進(jìn)行定量的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示在循環(huán)早期就可檢測(cè)到看家基因GAPDH的高表達(dá)，并且在任一時(shí)間點(diǎn)各組間GAPDH的表達(dá)都沒有差異(P>0.05)。 2、PTX對(duì)脊髓TNFαmRNA表達(dá)的影響。與術(shù)前相比較，CCI組TNFα mRNA起始模板量于術(shù)后1天

16、開始升高，并且高于Sham組(P<0.05)；14天時(shí)下降，21天時(shí)基本回到基礎(chǔ)水平(P>0.05)。與CCI組比較，PTX組TNFot mRNA起始模板量明顯降低(P<0.05)，術(shù)后1天時(shí)為CCI組的53％，術(shù)后7天時(shí)為CCI組的65％(P<0.05)，但仍高于Sham組(P<0.05)。 3、PTX對(duì)脊髓IL-1βmRNA表達(dá)的影響。與術(shù)前比較，CCI組IL-1β mRNA起始模板量于術(shù)后1天時(shí)為術(shù)前的4.4倍，并且高于S

17、ham組(P<0.05)；術(shù)后7天進(jìn)一步升高，為術(shù)前的5.7倍(P<0.05)；術(shù)后14天開始下降，但仍高于Sham組(P<0.05)。術(shù)后21天時(shí)三組間比較無顯著差異(P>0.05)。與CCI組比較，PTX組IL-1β mRNA起始模板量明顯降低(P<0.05)，但仍高于Sham組(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、成功復(fù)制CCI神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型，在此模型上觀察到明顯的機(jī)械性和熱痛覺過敏。 2、預(yù)先系統(tǒng)給