乙肝表面抗原S蛋白與纖維蛋白原α鏈相互作用的驗(yàn)證及功能學(xué)研究.pdf

1、目的：證實(shí)纖維蛋白原α鏈（FGA）作為乙型肝炎表面抗原S蛋白(HBS)結(jié)合蛋白一種候選蛋白,探討二者相互作用后在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能。
　　方法：1.提取人HepG2細(xì)胞RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出FGA基因。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)真核載體pcDNA6內(nèi)，構(gòu)建含F(xiàn)GA基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。同樣利用PCR技術(shù)，以HBS質(zhì)粒為模板擴(kuò)增HBS基因,構(gòu)建pCMV4-Flag-HBS基因表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功)，分別將重組質(zhì)

2、粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，用免疫熒光和Western blot等方法檢測(cè)FGA及HBS在293FT細(xì)胞中的表達(dá)。2.通過(guò)免疫共沉淀方法以及激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證HBS蛋白與FGA相互結(jié)合并明確HBS和FGA空間定位。3.構(gòu)建靶向FGA重組干擾質(zhì)粒siFGA-Pu6,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞以及HBS的穩(wěn)轉(zhuǎn)株中，篩選出4種穩(wěn)轉(zhuǎn)株（pCMV4+pU6,pCMV4+siFGA,HBs+pU6,and HBs+siFGA）。通過(guò)細(xì)胞CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋

3、亡實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)，探討FGA在肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)、侵襲、凋亡等方面的作用。通過(guò)蛋白芯片以及western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)Western blot結(jié)果顯示：FGA抗體孵育在72KD位置有目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；HBS抗體孵育在約26KD位置有預(yù)期蛋白表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示：FGA蛋白與HBS蛋白二者共同存在于細(xì)胞質(zhì)中。（2）內(nèi)源性免疫共沉淀結(jié)果：成功確認(rèn)FGA是HBsAg中小

4、S蛋白（HBS）結(jié)合蛋白一種候選蛋白。（3）細(xì)胞功能學(xué)研究表明：FGA蛋白與HBS蛋白結(jié)合后的HepG2細(xì)胞增殖加快、凋亡增快、遷移與侵襲能力未見(jiàn)明顯變化。而FGA蛋白表達(dá)或者高表達(dá)HBS蛋白的細(xì)胞均促進(jìn)增殖，單獨(dú)表達(dá)FGA的細(xì)胞抑制凋亡、遷移與侵襲能力，單獨(dú)表達(dá)HBS的細(xì)胞促進(jìn)凋亡、遷移與侵襲能力。（4）干擾細(xì)胞中FGA的表達(dá)后，可抑制信號(hào)通路中促增值因子Bcl-XL和Mcl-1的表達(dá)，并增加促凋亡因子蛋白的表達(dá)，并促使HepG2細(xì)胞