小鼠結(jié)腸癌EpCAM+-CD44+細(xì)胞對(duì)腫瘤區(qū)脈管生成的作用及三氧化二砷對(duì)其的影響.pdf

1、目的：研究小鼠大腸癌CT26細(xì)胞移植瘤EpCAM+/CD44+細(xì)胞對(duì)腫瘤脈管生成的作用。探討As2O3對(duì)人體大腸癌細(xì)胞SW620的作用機(jī)制，為As2O3應(yīng)用于大腸癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：1．體外實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)人大腸癌SW620細(xì)胞株，應(yīng)用不同濃度的As2O3(1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L)分別作用于細(xì)胞24h、48h、72h。用MTT法分別檢測各個(gè)時(shí)間不同濃度As2O3對(duì)細(xì)胞的抑制率；Hoec

2、hst33258熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)(PV法)檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)。
　　 2．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：復(fù)蘇并大量培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠大腸癌CT26細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液在小鼠腋窩皮下接種。反復(fù)傳代兩三次后，建立小鼠皮下移植瘤模型。模型成功后，將小鼠隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、As2O3低劑量治療組(治療劑量為1.0mg/kg·d)、As2O3高劑量治療組(治療劑量為2.0mg/kg·d)。連續(xù)

3、用藥10天，給藥期間每日觀察各組小鼠生活情況及移植瘤生長情況，末次用藥后24小時(shí)處死小鼠。分別測量各組小鼠體重、腫瘤重量和腫瘤體積，計(jì)算各組腫瘤抑制率；采用免疫組織化學(xué)(IHC)PV法檢測瘤組織EpCAM、CD44、VEGF-C、MMP-9、podoplanin、CD31、VEGFR-1和VEGFR-3的表達(dá)情況，并且計(jì)數(shù)微淋巴管密度(MLD)與微血管密度(MVD)。
　　 結(jié)果：1．體外實(shí)驗(yàn)：(1)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)顯

4、示：不同濃度的As2O3(1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L)作用SW620細(xì)胞24、48、72h后，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(0μmol/LAs2O3)相比，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制。各組間及與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同濃度的As2O3對(duì)SW620的增殖抑制作用隨著As2O3濃度的升高和作用時(shí)間的延長越來越明顯，即呈時(shí)間-濃度效應(yīng)依賴性。(2)Hoechst33258熒光染色法結(jié)果顯示：隨著藥物干預(yù)組As2O

5、3濃度的升高，熒光染色可見細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、固縮、形成凋亡小體以及核碎裂的形態(tài)學(xué)改變。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：各濃度藥物干預(yù)組中MMP-9陽性表達(dá)明顯降低，且隨著As2O3濃度增高，其降低作用越來越明顯。各組間及與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：(1)與生理鹽水組相比，As2O3藥物干預(yù)組中小鼠的皮下移植瘤生長均受到不同程度的抑制，以高濃度組的抑制作用更為明顯(P＜0.05)。

6、生理鹽水組、As2O3低劑量組、As2O3高劑量組腫瘤的重量分別為1.21±0.33、0.75±0.20、0.47±0.21(g)。(2)免疫組織化學(xué)顯示：與生理鹽水組相比，各濃度藥物干預(yù)組中EpCAM、CD44、VEGF-C、MMP-9、podoplanin、CD31、VEGFR-1和VEGFR-3的表達(dá)均不同程度降低，各組間及與生理鹽水組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),EpCAM、CD44與VEGF-C的表達(dá)均具有明顯的相

7、關(guān)性(P＜0.01)，VEGF-C與VEGFR-1和VEGFR-3的表達(dá)均具有明顯的相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：1.As2O3作用于大腸癌細(xì)胞的主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞的侵襲能力，且在高濃度組中的表現(xiàn)更為明顯。2.EpCAM和CD44可以聯(lián)合應(yīng)用作為大腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記物。3.As2O3可以抑制大腸癌中EpCAM、CD44、VEGF-C、MMP-9、podoplanin、CD31、VEGFR-1