MSCs的分離培養(yǎng)鑒定及MSCs-si NRSF的構建和檢測.pdf

1、目的:糖尿病是威脅人類健康的重要疾病。目前,移植胰島治療糖尿病已初見療效,但由于胰島來源匱乏和免疫排斥反應而受阻。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源廣泛,取材簡單,在體外易于分離、培養(yǎng)和純化,且具有多向分化的潛能,是進行細胞移植的理想種子細胞。然而MSCs向胰島細胞的誘導分化陽性比率低、分化細胞的胰島素分泌功能差等不足成為制約目前分化方案的主要障礙。神經(jīng)元限制性沉默因子(neuronal re

2、strictive silencing factor,NRSF),在胚胎干細胞及成體細胞中均有表達,但在成熟的神經(jīng)元和胰島細胞中卻沒有表達。因此提示NRSF在干細胞的干性維持及胰腺發(fā)育可能發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)干涉NRSF后的MSCs,經(jīng)過胰高血糖素GLP-1及bFGF等細胞生長因子的輔助誘導下,分化為胰島樣細胞的效率明顯增加。在本實驗中,我們通過RNA干涉技術,下調MSCs內源NRSF表達,并分析干涉NRSF后MSCs向胰島樣細胞

3、分化的能力。
　　 方法:
　　 無菌條件下,自正常成人骨髓分離單個核細胞,采用密度梯度離心和貼壁消化傳代的方法行體外擴增純化,經(jīng)流式細胞術鑒定表型、脂肪樣細胞方向誘導分化鑒定分化潛能,獲取合格MSCs;采用NRSF慢病毒干涉載體包裝人胚腎293FT細胞,收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)上清,轉染MSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率,建立穩(wěn)定干涉內源性NRSF的MSCs(MSCs-siNRSF);參照楊印祥等報道的方法,定向誘導

4、MSCs-siNRSF胰島樣細胞方向分化,雙硫腙染色鑒定胰島細胞形成,RT-PCR法檢測胰島素基因表達。
　　 結果:
　　 1.MSCs的形態(tài)學鑒定采用密度梯度離心和貼壁消化傳代的方法,自正常人骨髓獲取的細胞呈現(xiàn)典型的MSCs生長形態(tài)。
　　 2.MSCs的表型鑒定流式細胞檢測結果顯示,密度梯度離心和貼壁消化傳代的細胞高表達間質細胞標志CD44、CD90,不表達造血干細胞及成熟造血細胞標志CD3、CD49d。提

5、示分離獲取的細胞具有MSCs表性特征。
　　 3.MSCs的分化潛能鑒定經(jīng)定向誘導分化后,密度梯度離心和貼壁消化傳代的細胞胞質中可出現(xiàn)大小不一的脂滴,油紅染色后脂滴為紅色。提示分離獲取的細胞具有脂肪樣細胞分化潛能。
　　 4.MSCs-siNRSF的構建倒置熒光顯微鏡下觀察,攜帶綠色熒光蛋白慢病毒載體轉染后的MSCs,可見穩(wěn)定的綠色熒光信號。提示MSCs-siNRSF構建成功。
　　 5.MSCs-siNRSF胰

6、島樣細胞的定向誘導分化經(jīng)胰島樣細胞定向誘導分化后,MSCs-siNRSF逐漸變圓,并聚集成團;RT-PCR結果顯示胰島素基因表達;雙硫腙染色陽性。提示MSCs-siNRSF可成功誘導分化為胰島樣細胞。
　　 結論:
　　 1.采用密度梯度離心與貼壁消化傳代法,可獲得合格的MSCs。
　　 2.所分離的MSCs具有干細胞形態(tài)及分化潛能。
　　 3.成功地構建MSCs-siNRSF,進一步檢測有助于MSCs體