移植外源性MSCs持久恢復(fù)宿主MSCs功能的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來，MSCs治療已被廣泛應(yīng)用到多種人類疾病的治療中。研究表明，在動物模型以及臨床應(yīng)用中，MSCs治療可以有效緩解移植物抗宿主?。℅vHD）、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、心肌梗死、肝纖維化和多發(fā)性硬化癥等疾病的癥狀。我們的前期研究結(jié)果也表明MSCs治療可以有效緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）癥狀、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的血管化、殺傷多發(fā)性骨髓瘤、抑制皮膚增生性瘢痕和聲帶瘢痕。
　　在嘗試?yán)肕SCs治療多種疾病

2、的同時(shí)，研究者也在不斷地探索MSCs產(chǎn)生療效的機(jī)制。早期研究表明移植的供體 MSCs可以在宿主體內(nèi)存活，并且可以分化為多種成體細(xì)胞促進(jìn)組織再生。隨后，越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在大多數(shù)情況下，供體 MSCs并不會在宿主體內(nèi)存在足夠長的時(shí)間并通過分化過程產(chǎn)生療效。相反，越來越多的證據(jù)表明，MSCs可以通過分泌包括PGE2、TSG-6、VEGF和IL-10等多種可溶性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、促進(jìn)血管化或促進(jìn)組織再生。同時(shí)，也有研究證明供體

3、MSCs可以直接與宿主免疫細(xì)胞相互作用并誘導(dǎo)免疫耐受。盡管目前 MSCs治療的一些機(jī)制得以闡明，但是很多在MSCs治療應(yīng)用過程中觀察到的現(xiàn)象尚未得到解釋，MSCs產(chǎn)生療效的機(jī)制也尚未得到全面的闡明。其中，非常令人關(guān)注的是，在對絕大多數(shù)動物疾病模型和病人實(shí)施MSCs治療過程中，MSCs移植通常只進(jìn)行一次，但是MSCs治療所產(chǎn)生的療效卻可以持續(xù)較長的時(shí)間，這些證據(jù)表明MSCs治療可能通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的功能產(chǎn)生持久的療效，也就是產(chǎn)生了療效

4、的“記憶”。目前，這種MSCs治療所產(chǎn)生的穩(wěn)定療效的機(jī)制尚待闡明。
　　表觀遺傳調(diào)控是指在不改變DNA序列的情況下進(jìn)行的穩(wěn)定的基因表達(dá)調(diào)控，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及miRNA等方式。大量的研究表明，表觀遺傳調(diào)控在疾病的發(fā)生發(fā)展以及維持疾病性狀中起到了重要的作用。同時(shí)，利用多種治療手段通過干預(yù)疾病狀態(tài)下異常的表觀遺傳狀態(tài)可以產(chǎn)生持久的療效。
　　綜上所述，我們提出假設(shè)：在MSCs治療過程中，供體MSCs可以通過調(diào)節(jié)

5、宿主細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生穩(wěn)定的治療效果。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人相似，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠（MRL/lpr小鼠，含F(xiàn)as基因突變）具有受損的BMMSCs成骨分化潛能和顯著的骨質(zhì)疏松癥狀。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，單次MSCs治療可以持久和有效地恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化潛能并緩解MRL/lpr小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。在本研究中，我們利用MRL/lpr小鼠模型探索MSCs治療產(chǎn)生持久療效的分子調(diào)控機(jī)制。
　　研究

6、目的：
　　在MRL/lpr小鼠模型中，明確系統(tǒng)注射MSCs所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥狀并恢復(fù)宿主BMMSCs成骨分化功能的持久性療效，探索表觀遺傳調(diào)控尤其是DNA甲基化修飾在MSCs治療所產(chǎn)生的持久性療效中的作用，闡明供體MSCs如何調(diào)節(jié)宿主BMMSCs的表觀遺傳學(xué)特性。本研究為逆轉(zhuǎn)異常的表觀遺傳狀態(tài)提供新的干預(yù)手段，并為MSCs治療的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論支持。
　　研究方法：
　　1. MSCs治療產(chǎn)生的短期和持久

7、療效。在MRL/lpr小鼠模型中，以系統(tǒng)注射的方式進(jìn)行MSCs治療，通過μCT和鈣黃綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)觀察MSCs治療對骨質(zhì)疏松癥狀的短期及長期療效，并通過茜素紅染色、Western blot以及裸鼠皮下埋植成骨觀察MSCs治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能恢復(fù)的短期及長期療效。
　　2. MSCs治療對宿主BMMSCs甲基化狀態(tài)的調(diào)節(jié)。通過DNA甲基化芯片分析MSCs治療前后MRL/lpr小鼠BMMSCs全基因組DNA甲

8、基化模式的變化，觀察DNA甲基化抑制劑5-Azacytidine對MSCs治療效果的抑制作用。
　　3.宿主 BMMSCs的 Notch信號通路相關(guān)基因的甲基化水平及其功能。利用 DNA甲基化芯片分析與BMMSCs成骨分化功能相關(guān)的Notch信號通路基因的DNA甲基化水平的變化，利用亞硫酸鹽測序法對其進(jìn)行驗(yàn)證，利用Western Blot明確MSCs治療前后 Notch信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察 Notch

9、信號通路的抑制劑DAPT對恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的和緩解MRL/lpr小鼠骨質(zhì)疏松癥狀的作用。
　　4.Dnmt1對Notch信號通路相關(guān)基因甲基化水平的調(diào)控。利用Western Blot檢測MSCs治療前后MRL/lpr小鼠BMMSCs中Dnmt1的表達(dá)，利用siRNA和茜素紅染色觀察Dnmt1在小鼠BMMSCs成骨分化中的作用，通過siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒分別抑制和過表達(dá)Dnmt1，結(jié)合DAPT的使用進(jìn)一步檢測D

10、nmt1通過Notch信號通路調(diào)控BMMSCs成骨分化功能。
　　5. miR-29b對Dnmt1表達(dá)水平的調(diào)控。利用microRNA芯片分析篩選MSCs治療前后恢復(fù)表達(dá)的microRNA并利用real-time PCR明確miR-29b的表達(dá)水平，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用inhibitor抑制miR-29b的表達(dá)，并觀察其對Dnmt1的表達(dá)、對Notch信號通路的調(diào)節(jié)以及對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復(fù)和骨質(zhì)疏松癥狀的

11、緩解作用，利用mimics過表達(dá)miR-29b，并觀察其對Dnmt1的表達(dá)、對Notch信號通路的調(diào)節(jié)以及對BMMSCs成骨分化功能的抑制作用。
　　6.供體 MSCs來源的 exosome對宿主 BMMSCs的 miR-29b水平的調(diào)控。利用transwell建立正常小鼠BMMSCs和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)對MRL/lpr小鼠BMMSCs功能的恢復(fù)作用。通過使用siRNA抑制Rab27a的表達(dá)從而抑

12、制exosome的分泌，明確exosome分泌在共培養(yǎng)體系及在MSCs治療中的作用。系統(tǒng)注射exosome，觀察exosome治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs的Dnmt1和Notch信號通路的調(diào)節(jié)、對其BMMSCs功能的恢復(fù)以及對骨質(zhì)疏松癥狀的緩解。7.宿主BMMSCs利用供體來源的Fas蛋白控制miR-29b的分泌。利用siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒分別抑制和過表達(dá)Fas，觀察Fas對miR-29b分泌的調(diào)控作用，分別使用正常小鼠和MRL

13、/lpr小鼠BMMSCs來源exosome和MRL/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)，觀察不同來源exosome對MRL/lpr小鼠BMMSCs分泌miR-29b功能的調(diào)控，構(gòu)建Fas-EGFP融合蛋白用以對Fas蛋白示蹤，將表達(dá)Fas-EGFP融合蛋白的exosome與MRL/lpr小鼠 BMMSCs共培養(yǎng)并系統(tǒng)注射，觀察免疫熒光染色觀察 MRL/lpr小鼠BMMSCs中Fas-EGFP融合蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1

14、. MSCs治療產(chǎn)生了持久的療效。與正常對照小鼠（C3H/HeJ小鼠）來源的BMMSCs相比較，MRL/lpr小鼠來源的BMMSCs具有較低的體內(nèi)和內(nèi)外成骨分化潛能。同時(shí)，與正常對照小鼠相比較，MRL/lpr小鼠具有顯著的骨質(zhì)疏松癥狀。實(shí)施MSCs治療4星期之后，MSCs治療顯著的恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs受損的成骨分化潛能，并且顯著的緩解了MRL/lpr小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。更為重要的是，實(shí)施MSCs治療12星期后，MSCs治

15、療依然保持了對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復(fù)和骨質(zhì)疏松的緩解作用。
　　2. MSCs治療恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs的DNA甲基化狀態(tài)。MRL/lpr小鼠的BMMSCs具有異常的全基因組DNA甲基化模式和較低的甲基化水平，MSCs治療以后，這種異常的模式和水平得到了恢復(fù)。DNA甲基化抑制劑5-Azacytidine顯著抑制了MSCs治療對MRL/lpr小鼠BMMSCs成骨分化功能的恢復(fù)和對骨質(zhì)疏松癥狀的

16、緩解。
　　3. MSCs治療恢復(fù)了宿主 BMMSCs的 Notch通路相關(guān)基因的 DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Notch通路相關(guān)基因具有較低的DNA甲基化水平和較高的表達(dá)水平，MSCs治療恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch通路相關(guān)基因甲基化水平并恢復(fù)了Notch信號通路的激活水平。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，DAPT顯著的恢復(fù)了MRL/lpr小鼠的成骨分化能力并顯著的緩解了MRL/lpr小鼠的骨質(zhì)疏

17、松癥狀。4. Dnmt1調(diào)控Notch通路相關(guān)基因的DNA甲基化水平。MRL/lpr小鼠的BMMSCs的Dnmt1表達(dá)水平較低。在C3H/HeJ小鼠的BMMSCs中，降低Dnmt1的表達(dá)可以降低Notch1甲基化水平，激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化。在MRL/lpr小鼠的BMMSCs中，過表達(dá)Dnmt1可以恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1的DNA甲基化水平和Notch通路表達(dá)水平，并恢復(fù)其成骨分化能力。<

18、br>　　5. miR-29b負(fù)調(diào)控Dnmt1的表達(dá)。MRL/lpr小鼠BMMSCs具有高表達(dá)的miR-29b水平，MSCs治療恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs的miR-29b水平。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，抑制miR-29b的表達(dá)可以顯著恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs的Notch1和Dnmt1表達(dá)，恢復(fù)其BMMSCs成骨分化能力并緩解其骨質(zhì)疏松癥狀。在正常對照小鼠的BMMSCs中，過表達(dá)miR-29b可以抑制Dnmt1表達(dá)、降低Notch

19、1基因DNA甲基化水平、激活Notch通路并抑制BMMSCs的成骨分化能力。
　　6.供體MSCs分泌exosome下調(diào)宿主BMMSCs的miR-29b表達(dá)。與正常對照小鼠BMMSCs共培養(yǎng)可以恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs的miR-29b、Dnmt1和Notch1的表達(dá)水平并恢復(fù)其成骨分化能力，抑制正常小鼠BMMSCs的exosome分泌可以削弱這種恢復(fù)作用。同時(shí)，抑制供體 MSCs的 exosome分泌顯著削弱了MSCs治

20、療對MRL/lpr小鼠BMMSCs的miR-29b、Dnmt1和Notch1表達(dá)水平的恢復(fù)和對其成骨分化能力的恢復(fù)。直接注射exosome顯著恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs的miR-29b、Dnmt1和Notch1表達(dá)水平、恢復(fù)了其成骨分化能力并緩解了MRL/lpr小鼠骨質(zhì)疏松癥狀。
　　7.宿主BMMSCs利用供體exosome來源的Fas蛋白釋放胞內(nèi)的miR-29b。在正常小鼠的BMMSCs中，抑制Fas的表達(dá)可以提高胞

21、內(nèi)miR-29b的量并抑制miR-29b的釋放；同時(shí)，在MRL/lpr小鼠BMMSCs中，過表達(dá)Fas可以降低胞內(nèi)miR-29b的量并促進(jìn)miR-29b的釋放。Fas的抑制和過表達(dá)不影響miR-29b的原始轉(zhuǎn)錄水平。正常小鼠BMMSCs來源的exosome可恢復(fù)MRL/lpr小鼠BMMSCs胞內(nèi)和分泌miR-29b的水平，而MRL/lpr小鼠BMMSCs來源的exosome沒有此功能。將含有Fas-EGFP融合蛋白的exosome與MR

22、L/lpr小鼠BMMSCs共培養(yǎng)或給予MRL/lpr小鼠系統(tǒng)注射后，均可在MRL/lpr小鼠BMMSCs中觀察到融合蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　本研究證實(shí)，在MRL/lpr小鼠模型中，F(xiàn)as蛋白功能的缺失導(dǎo)致miR-29b分泌受阻進(jìn)而導(dǎo)致miR-29b胞內(nèi)水平升高，而高水平的miR-29b通過抑制Dnmt1的表達(dá)降低了Notch通路相關(guān)基因的DNA甲基化水平從而激活Notch通路。最終，Notch通路的激活抑制了MRL

23、/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并導(dǎo)致了其骨質(zhì)疏松癥狀。實(shí)施MSCs治療后，供體MSCs分泌了含有正常功能Fas蛋白的exosome，MRL/lpr小鼠BMMSCs通過exosome利用了供體來源的Fas蛋白促進(jìn)胞內(nèi)miR-29b的釋放，進(jìn)而恢復(fù)了Dnmt1和Notch通路相關(guān)基因的DNA甲基化水平和表達(dá)水平，最終持久性的恢復(fù)了MRL/lpr小鼠BMMSCs的成骨分化能力并緩解了其骨質(zhì)疏松癥狀。在本研究中，我們通過闡明Fas/mi