自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用-調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞BAFF的表達(dá).pdf

1、目的：探討自噬在SLE發(fā)病中的作用。
　　方法：首先對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）病人外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）中自噬相關(guān)基因的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)自噬是否參與SLE的發(fā)病進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。其次用活化淋巴細(xì)胞來(lái)源DNA（ALD-DNA）采用皮下多點(diǎn)注射方法隔周免疫6-8周齡BALB/c小鼠，三次免疫后檢測(cè)血清anti-dsDNA抗體水平和小鼠尿蛋白水平，對(duì)小鼠腎臟做病理切片H&E染色，以及檢測(cè)腎臟免疫復(fù)合物沉積，判斷SLE小鼠模型是否

2、成功建立。對(duì)SLE小鼠外周血淋巴細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。而后在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE小鼠模型中用Beclin1-shRNA下調(diào)自噬，通過(guò)對(duì)小鼠anti-dsDNA抗體、尿蛋白、腎臟病理的檢測(cè)，判斷SLE病情是否得到改善。選擇巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，用Western Blot對(duì)SLE小鼠腎臟和脾臟巨噬細(xì)胞進(jìn)行自噬標(biāo)志分子LC3進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步在體外以巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象，確定ALD-DNA刺激下巨噬細(xì)胞中

3、自噬的發(fā)生：Western Blot檢測(cè)LC3變化；用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7，再用ALD-DNA刺激，檢測(cè)GFP-LC3的胞內(nèi)定位情況。進(jìn)而利用3-MA抑制自噬，檢測(cè)巨噬細(xì)胞功能：用Griess法測(cè) NO含量檢測(cè)巨噬細(xì)胞NO分泌情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80和CD86分子為標(biāo)志的巨噬細(xì)胞活化情況，ELISA和Real-Time PCR檢測(cè)SLE相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-6， IL-8，TNF-α，IL-10，IL-1β，TG

4、F-β和BAFF表達(dá)水平的改變。通過(guò)FITC微球吞噬檢測(cè)在自噬發(fā)生與抑制情況下巨噬細(xì)胞吞噬能力的改變。最后，我們針對(duì)BAFF如何受到自噬的調(diào)控進(jìn)行探討，通過(guò)Western Blot檢測(cè)與BAFF相關(guān)的信號(hào)通路，確定自噬調(diào)控BAFF的途徑。
　　結(jié)果：SLE病人PBMC中atg5的mRNA水平約高于正常人36倍，beclin1的mRNA水平約高于正常人5倍，lc3b的 mRNA水平約高于正常人45倍。在ALD-DNA三次免疫后，小鼠

5、anti-dsDNA抗體水平和尿蛋白水平升高，腎小球腎炎明顯，腎臟免疫復(fù)合物沉積增多，表明我們成功建立SLE小鼠模型。SLE小鼠PBMC中atg12的mRNA水平約高于正常組45倍，atg5的mRNA水平約高于正常組100倍以上，beclin1的mRNA水平約高于正常組150倍左右。而后，我們?cè)贏LD-DNA誘導(dǎo)SLE的同時(shí)用Beclin1-shRNA免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)具有良好的保護(hù)效果：尿蛋白水平下降，抗核抗體水平下降，以及腎臟病理情況的

6、改善都表明自噬的抑制能緩解ALD-DNA誘導(dǎo)SLE的發(fā)病。Western blot結(jié)果顯示，在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE小鼠脾臟和腎臟巨噬細(xì)胞中，LC3顯著高于對(duì)照組與正常組，即SLE小鼠巨噬細(xì)胞自噬水平顯著高于較對(duì)照組。利用巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)行體外研究，證實(shí)ALD-DNA的刺激可以直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬水平的升高：Western Blot顯示ALD-DNA在RAW264.7中上調(diào)LC3，并促使GFP-LC3從彌散分布轉(zhuǎn)變?yōu)辄c(diǎn)狀

7、聚集。ALD-DNA能夠在巨噬細(xì)胞中直接激活自噬這一結(jié)果提示自噬可能在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。3-MA抑制自噬后，巨噬細(xì)胞功能發(fā)生顯著改變，其中檢測(cè)到CD80、CD86分子表達(dá)水平隨自噬的抑制而下降；NO分泌減少；CD80、CD86分子表達(dá)降低；巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的變化復(fù)雜：IL-6， IL-8，TNF-α和BAFF在自噬受到抑制后顯著下降；MCP-1表達(dá)上升；IL-10，IL-1β， TGF-β的改變不受影響。