人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞的培養(yǎng)、觀察及其腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng).pdf

1、目的:
　　 1.為了獲得人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞，為建立人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系奠定前期基礎(chǔ)。
　　 2.初步了解人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)、細(xì)胞標(biāo)志物和電鏡結(jié)構(gòu)，為深入了解該細(xì)胞提供理論依據(jù)。
　　 3.證實(shí)人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，并進(jìn)行初步分離培養(yǎng)和血清誘導(dǎo)分化，為深入研究人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞提供理論支持。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)第一部

2、分:取天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院（原天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心）2011年5月一例原發(fā)淚腺腺樣囊性癌患者的新鮮腫瘤組織，采用組織塊培養(yǎng)法，獲得原代細(xì)胞。運(yùn)用連續(xù)傳代、機(jī)械刮除、反復(fù)貼壁和消化排除等方法去除雜細(xì)胞。利用相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡等觀察細(xì)胞形態(tài)。采取細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞波形蛋白(vimentin)、廣譜細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，pan)、S-100蛋白、結(jié)蛋白(desmin)、CD34等蛋白的表達(dá)情況。采用免疫組織化學(xué)法

3、檢測(cè)腫瘤組織vimentin、cytokeratin(pan)、S-100蛋白、desmin等蛋白的表達(dá)情況。消化法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。
　　 2.實(shí)驗(yàn)第二部分:采用無(wú)血清培養(yǎng)法從人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞中分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行血清誘導(dǎo)分化，證明其具有自我更新、不斷增殖及可逆分化能力。
　　 結(jié)果:
　　 1.國(guó)內(nèi)外首次成功獲得可穩(wěn)定傳代的人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞(lacrimal aden

4、oidcystic carcinoma，LACC):組織塊原代培養(yǎng)第5天見周圍開始有細(xì)胞爬出，此后細(xì)胞緩慢增殖，第32天進(jìn)行首次傳代，第69天發(fā)現(xiàn)典型的上皮樣細(xì)胞克隆。運(yùn)用多種方法去除雜細(xì)胞，至第8代細(xì)胞基本純化。純化后細(xì)胞已穩(wěn)定傳至100代以上。
　　 2.LACC細(xì)胞具有以下形態(tài)學(xué)特征:1）相差顯微鏡下觀察:細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，核類圓形，核漿比高，核仁數(shù)個(gè);核分裂相多見，可見瘤巨細(xì)胞;細(xì)胞排列不緊密時(shí)，細(xì)胞可呈長(zhǎng)橢圓形、三角形、梭

5、形、多角形等多種形態(tài);細(xì)胞排列緊密時(shí)，呈多邊形的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為典型的“鋪路石”樣生長(zhǎng);密度繼續(xù)增高時(shí)，細(xì)胞接觸抑制消失。2）透射電鏡和掃描電鏡下觀察:細(xì)胞呈現(xiàn)低分化惡性腫瘤細(xì)胞的典型特點(diǎn)，核漿比倒置，胞漿少，胞核大，異型性明顯;核仁1至數(shù)個(gè)，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，常染色質(zhì)多見，異染色質(zhì)邊集;不同細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器發(fā)育差別大;細(xì)胞間信號(hào)溝通豐富，絲狀偽足多級(jí)分支。3)細(xì)胞免疫化學(xué)法觀察細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá):vimentin、cytokeratin

6、(pan)和S-100蛋白呈陽(yáng)性，desmin、CD34蛋白呈陰性，與源腫瘤組織染色結(jié)果一致。4)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線類似“S”形，細(xì)胞倍增時(shí)間37.1h。
　　 3.利用無(wú)血清培養(yǎng)基從人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞中成功獲得呈類球形或葡萄串樣細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)的人LACC腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。LACC細(xì)胞接種到無(wú)血清培養(yǎng)基24h后，即可觀察到細(xì)胞團(tuán)懸浮生長(zhǎng)或半貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨時(shí)間和傳代增加，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大

7、。
　　 4.人LACC腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)經(jīng)血清誘導(dǎo)后可貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)與LACC細(xì)胞相似。
　　 結(jié)論:
　　 1.國(guó)內(nèi)外首次獲得純化的人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞，為建立穩(wěn)定、永久的人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系奠定了前期基礎(chǔ)，為深入研究人淚腺腺樣囊性癌的生物學(xué)行為機(jī)制提供了重要的種子細(xì)胞。
　　 2.證實(shí)了人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有自我更新、不斷增殖及可逆分化等腫瘤干細(xì)胞特性，為人淚