人淚腺腺樣囊性癌細胞的培養(yǎng)、觀察及其腫瘤干細胞樣細胞的分離培養(yǎng).pdf

1、目的:
　　 1.為了獲得人淚腺腺樣囊性癌細胞，為建立人淚腺腺樣囊性癌細胞系奠定前期基礎(chǔ)。
　　 2.初步了解人淚腺腺樣囊性癌細胞的形態(tài)學(xué)特征，包括細胞形態(tài)、生長特點、細胞標志物和電鏡結(jié)構(gòu)，為深入了解該細胞提供理論依據(jù)。
　　 3.證實人淚腺腺樣囊性癌細胞中存在腫瘤干細胞樣細胞，并進行初步分離培養(yǎng)和血清誘導(dǎo)分化，為深入研究人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細胞提供理論支持。
　　 方法:
　　 1.實驗第一部

2、分:取天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院（原天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心）2011年5月一例原發(fā)淚腺腺樣囊性癌患者的新鮮腫瘤組織，采用組織塊培養(yǎng)法，獲得原代細胞。運用連續(xù)傳代、機械刮除、反復(fù)貼壁和消化排除等方法去除雜細胞。利用相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡等觀察細胞形態(tài)。采取細胞免疫化學(xué)法檢測細胞波形蛋白(vimentin)、廣譜細胞角蛋白(cytokeratin，pan)、S-100蛋白、結(jié)蛋白(desmin)、CD34等蛋白的表達情況。采用免疫組織化學(xué)法

3、檢測腫瘤組織vimentin、cytokeratin(pan)、S-100蛋白、desmin等蛋白的表達情況。消化法繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間。
　　 2.實驗第二部分:采用無血清培養(yǎng)法從人淚腺腺樣囊性癌細胞中分離培養(yǎng)腫瘤干細胞樣細胞，并對其進行血清誘導(dǎo)分化，證明其具有自我更新、不斷增殖及可逆分化能力。
　　 結(jié)果:
　　 1.國內(nèi)外首次成功獲得可穩(wěn)定傳代的人淚腺腺樣囊性癌細胞(lacrimal aden

4、oidcystic carcinoma，LACC):組織塊原代培養(yǎng)第5天見周圍開始有細胞爬出，此后細胞緩慢增殖，第32天進行首次傳代，第69天發(fā)現(xiàn)典型的上皮樣細胞克隆。運用多種方法去除雜細胞，至第8代細胞基本純化。純化后細胞已穩(wěn)定傳至100代以上。
　　 2.LACC細胞具有以下形態(tài)學(xué)特征:1）相差顯微鏡下觀察:細胞貼壁生長，核類圓形，核漿比高，核仁數(shù)個;核分裂相多見，可見瘤巨細胞;細胞排列不緊密時，細胞可呈長橢圓形、三角形、梭

5、形、多角形等多種形態(tài);細胞排列緊密時，呈多邊形的上皮樣細胞形態(tài)，表現(xiàn)為典型的“鋪路石”樣生長;密度繼續(xù)增高時，細胞接觸抑制消失。2）透射電鏡和掃描電鏡下觀察:細胞呈現(xiàn)低分化惡性腫瘤細胞的典型特點，核漿比倒置，胞漿少，胞核大，異型性明顯;核仁1至數(shù)個，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，常染色質(zhì)多見，異染色質(zhì)邊集;不同細胞內(nèi)細胞器發(fā)育差別大;細胞間信號溝通豐富，絲狀偽足多級分支。3)細胞免疫化學(xué)法觀察細胞標志物的表達:vimentin、cytokeratin

6、(pan)和S-100蛋白呈陽性，desmin、CD34蛋白呈陰性，與源腫瘤組織染色結(jié)果一致。4)細胞生長動力學(xué)分析:細胞生長曲線類似“S”形，細胞倍增時間37.1h。
　　 3.利用無血清培養(yǎng)基從人淚腺腺樣囊性癌細胞中成功獲得呈類球形或葡萄串樣細胞團生長的人LACC腫瘤干細胞樣細胞。LACC細胞接種到無血清培養(yǎng)基24h后，即可觀察到細胞團懸浮生長或半貼壁生長，細胞團內(nèi)細胞形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，隨時間和傳代增加，細胞團逐漸增大

7、。
　　 4.人LACC腫瘤干細胞樣細胞團經(jīng)血清誘導(dǎo)后可貼壁生長，貼壁細胞形態(tài)特點與LACC細胞相似。
　　 結(jié)論:
　　 1.國內(nèi)外首次獲得純化的人淚腺腺樣囊性癌細胞，為建立穩(wěn)定、永久的人淚腺腺樣囊性癌細胞系奠定了前期基礎(chǔ)，為深入研究人淚腺腺樣囊性癌的生物學(xué)行為機制提供了重要的種子細胞。
　　 2.證實了人淚腺腺樣囊性癌細胞中存在腫瘤干細胞樣細胞，具有自我更新、不斷增殖及可逆分化等腫瘤干細胞特性，為人淚