肽脫甲?；傅谋磉_純化及其抑制劑的研究.pdf

1、目的：
　　 肽脫甲?；?PDF，peptide deformylase)是篩選新型抗生素的一個理想靶點，其抑制劑的研究引起了廣泛的關(guān)注。在本研究中，通過不同的表達純化方法，獲得穩(wěn)定性好、活性高的大腸桿菌和金黃色葡萄菌的PDF，建立PDF抑制劑的篩選模型。檢測其抑制劑對兩種PDF的抑制效果，同時檢測PDF抑制劑的最小抑菌濃度(MIC，minimal inhibitory concentration)，對抑制劑進行篩選。為PDF

2、性質(zhì)的研究和新型抗生素的篩選奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.將大腸桿菌PDF表達質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，對誘導(dǎo)表達的條件進行摸索，并進行PDF蛋白的大量表達。
　　 2.通過離子交換層析和分子篩層析，對大腸桿菌PDF進行純化。
　　 3.檢測大腸桿菌PDF的活性及穩(wěn)定性。
　　 4.構(gòu)建金黃色葡萄球菌PDF重組表達質(zhì)粒pET-22b-def。

3、>　　 5.將金黃色葡萄球菌PDF表達質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸菌BL21(DE3)中，進行誘導(dǎo)表達，采用瓊脂糖磁珠對其進行純化，得到不含離子的PDF；在純化過程中加入氯化鎳，得到鎳離子PDF；在表達和純化過程中加入氯化鐵，得到富含鐵離子的PDF。
　　 6.對金黃色葡萄球菌三種不同形式的PDF進行活性比較，并對抑制劑篩選模型的條件進行摸索，建立合適的篩選模型。
　　 7.檢測化合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球

4、菌PDF的IC50值。
　　 8.應(yīng)用微量稀釋法敏感實驗的方法檢測了39種化合物對4株革蘭陰性菌和4株革蘭陽性菌的MIC值。
　　 結(jié)果：
　　 1.在30℃下，經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達4小時，大腸桿菌PDF蛋白在宿主菌中得到大量表達。1L菌液可表達蛋白約30mg。
　　 2.經(jīng)過離子交換層析和分子篩層析純化后，得到了高純度的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白。
　　 3.活性檢測證實我們得到了活性

5、高、穩(wěn)定性好的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白，可用于PDF抑制劑的篩選。
　　 4.重組菌落PCR鑒定和基因測序表明，我們成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌PDF表達質(zhì)粒pET-22b-def。
　　 5.在不同的表達和純化條件下，得到了高純度的未加入離子的PDF、含鎳離子PDF、富含鐵離子PDF三種不同形式的金黃色葡萄球菌PDF蛋白。
　　 6.金黃色葡萄球菌不含離子PDF、鎳離子PDF和富含鐵離子PDF經(jīng)活性比較發(fā)現(xiàn)，富

6、含鐵離子PDF活性最高，并用于體外PDF抑制劑的篩選實驗。
　　 7.檢測了39種化合物對大腸桿菌PDF抑制效果，與陽性對照藥物放線酰胺(actinonin)相比較，未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。另外檢測了19種化合物對金黃色葡萄球菌PDF的抑制效果，亦未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。
　　 8.在微量稀釋法敏感實驗中，與陽性對照藥慶大霉素相比，所篩選化合物抑菌效果差于慶大霉素，與actinon

7、in相比，BLC-44對大腸桿菌和克雷伯肺炎桿菌的抑菌效果優(yōu)于actinonin，其他藥物抑菌效果不及actinonin。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)表達純化，獲得了穩(wěn)定性好及活性高的大腸桿菌Ni2+-PDF和金黃色葡萄球菌的富含鐵離子PDF蛋白，并建立了PDF抑制劑的篩選的實驗?zāi)Ｐ?。對化合物進行了篩選，與陽性對照藥actinonin相比，未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。在MIC的檢測中，亦未發(fā)現(xiàn)抑菌效果好藥物。