成骨細胞玻璃化冷凍保護劑的研究.pdf

1、該文的研究目的是篩選適合成骨細胞的玻璃化溶液組成,為成骨細胞及骨組織玻璃化保存提供有價值的參考知識.首先選用三種滲透性冷凍保護劑:二甲基亞砜(DMSO 45%w/w)、2,3-丁二醇(BD 32%w/w)和1,2-丙二醇(PD 45%w/w),分別用低溫顯微鏡系統(tǒng)和差示量熱掃描儀(DSC)觀察其玻璃化能力和現象,并確定其低溫斷裂溫度、玻璃化轉變溫度和濃度.為降低滲透性玻璃化溶液的濃度,用糖類非滲透性冷凍保護劑一海藻糖、蔗糖、葡萄糖代替一

2、部分滲透性冷凍保護劑,并用低溫顯微系統(tǒng)觀察其玻璃化能力,從而確定實驗用的玻璃化溶液的濃度.研究結果表明:除BD(40%w/w)玻璃化濃度高于文獻報道外,DMSO和PD均與文獻相符.采用糖類能夠降低滲透性保護劑的濃度,溶液也可以實現玻璃化.另外,快速冷凍易于抑制溶液中冰晶的生長,可以達到較好的玻璃化效果.該實驗采用的玻璃化溶液在冷凍過程中都不同程度地出現了低溫斷裂現象.斷裂溫度低于玻璃化轉變溫度,為避免玻璃體斷裂對細胞和組織產生的損傷,推

3、薦以不產生低溫斷裂的冷凍速率降溫到介于其玻璃化轉變溫度和低溫斷裂溫度之間的某一溫度,并在此狀態(tài)保存.選定了玻璃化溶液后,先確定玻璃化溶液對成骨細胞活性影響的實驗方法:0~4℃,在成骨細胞中導入玻璃化溶液,平衡5min,室溫下(~20℃)用培養(yǎng)基分兩次洗脫后,接種到孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)24hr后,用MTT比色法檢測細胞活性.用此實驗方法,比較滲透性玻璃化溶液,PD中加入糖類的玻璃化溶液和DMSO中加入糖類的玻璃化溶液對成骨細胞活性的影響.結果

4、表明:三種滲透性冷凍保護劑單獨使用時,細胞成活率都很低,在10%左右,說明三種滲透性冷凍保護劑單獨使用對細胞的毒性都很大.在PD中加入糖類,對細胞成活率沒有顯著提高,而在DMSO中加入糖類,顯著提高了細胞成活率.其中,以39%DMSO+6%海藻糖的效果最好,成活率達到46.4%.利用K-K模型模擬計算了單濃度一次性導入和多濃度分步導入冷凍保護劑對成骨細胞體積的變化.結果表明:單濃度一次性導入時,隨著冷凍保護劑濃度的增大,冷凍保護劑的滲透