神經(jīng)干細(xì)胞的玻璃化冷凍保存研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCells，NSCs)的低溫冷凍保存對于神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)組織損傷的研究與治療具有十分重要的意義。為改善神經(jīng)干細(xì)胞的冷凍保存效果，本課題采用近年來迅速發(fā)展起來的無冰晶保存技術(shù)——玻璃化法對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。 本文首先根據(jù)低溫保護(hù)劑(CPA)導(dǎo)入過程的細(xì)胞體積變化情況設(shè)計了等滲透壓差、時間間隔逐漸降低的六步導(dǎo)入方法，并對神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液的玻璃化進(jìn)行優(yōu)化，且對凍后復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)觀察和干

2、細(xì)胞特性鑒定。然后分別采用兩種不同的神經(jīng)球尺度篩選方法——培養(yǎng)時間分布法和細(xì)胞篩網(wǎng)法獲得不同直徑范圍的神經(jīng)球，用滲透壓儀測定保護(hù)劑一次性導(dǎo)入不同尺度的神經(jīng)球后的滲透壓變化曲線，根據(jù)滲透平衡時間，設(shè)計不同的導(dǎo)入方法，并進(jìn)行玻璃化凍存，用CCK-8法比較玻璃化組、慢凍組及導(dǎo)入組凍后細(xì)胞的相對活性。分別采用Hoechst/PI雙染法鑒定凍后細(xì)胞球的完整性，采用nestin特異性蛋白鑒定凍后NSCs的干細(xì)胞特性，并將凍后細(xì)胞誘導(dǎo)分化，進(jìn)行神經(jīng)干

3、細(xì)胞多向分化能力的免疫熒光鑒定。 實驗結(jié)果顯示，采用每步導(dǎo)入CPA的體積為50μl、64μl、86μl、120μl、18μl、300μl，每步導(dǎo)入后對應(yīng)的平衡時間分別為85s、75s、65s、55s、45s.35s的導(dǎo)入方案對NSCs進(jìn)行玻璃化凍存，凍后細(xì)胞活率達(dá)到了85.5％，且仍具有良好的生長狀態(tài)和較強(qiáng)的增殖能力，經(jīng)Nestin特異性蛋白鑒定，凍后細(xì)胞仍具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，這說明采用等滲透壓差、平衡時間間隔逐漸減小的分步導(dǎo)入

4、方法可以有效地減輕細(xì)胞的滲透性損傷和毒性損傷。實驗結(jié)果還表明，CPA一次性導(dǎo)入各尺度范圍的神經(jīng)球所需的滲透平衡時間是隨細(xì)胞球的尺度和單位體積細(xì)胞數(shù)的增大而增大的。在本實驗所選取的直徑范圍(<100μm)內(nèi)，對比玻璃化法和常規(guī)慢速凍存法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過兩種方法凍后細(xì)胞的相對活性都隨著神經(jīng)細(xì)胞球尺度的增加而增加，但是采用玻璃化法冷凍保存的神經(jīng)球，其凍后細(xì)胞活性以及其在維持球狀形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性方面都要顯著好于常規(guī)慢速凍存法。且玻璃化法冷凍保存后的