神經干細胞的玻璃化冷凍保存研究.pdf

1、神經干細胞(NeuralStemCells，NSCs)的低溫冷凍保存對于神經退行性疾病和神經組織損傷的研究與治療具有十分重要的意義。為改善神經干細胞的冷凍保存效果，本課題采用近年來迅速發(fā)展起來的無冰晶保存技術——玻璃化法對神經干細胞進行冷凍保存。 本文首先根據(jù)低溫保護劑(CPA)導入過程的細胞體積變化情況設計了等滲透壓差、時間間隔逐漸降低的六步導入方法，并對神經干細胞單細胞懸液的玻璃化進行優(yōu)化，且對凍后復蘇的細胞進行培養(yǎng)觀察和干

2、細胞特性鑒定。然后分別采用兩種不同的神經球尺度篩選方法——培養(yǎng)時間分布法和細胞篩網法獲得不同直徑范圍的神經球，用滲透壓儀測定保護劑一次性導入不同尺度的神經球后的滲透壓變化曲線，根據(jù)滲透平衡時間，設計不同的導入方法，并進行玻璃化凍存，用CCK-8法比較玻璃化組、慢凍組及導入組凍后細胞的相對活性。分別采用Hoechst/PI雙染法鑒定凍后細胞球的完整性，采用nestin特異性蛋白鑒定凍后NSCs的干細胞特性，并將凍后細胞誘導分化，進行神經干

3、細胞多向分化能力的免疫熒光鑒定。 實驗結果顯示，采用每步導入CPA的體積為50μl、64μl、86μl、120μl、18μl、300μl，每步導入后對應的平衡時間分別為85s、75s、65s、55s、45s.35s的導入方案對NSCs進行玻璃化凍存，凍后細胞活率達到了85.5％，且仍具有良好的生長狀態(tài)和較強的增殖能力，經Nestin特異性蛋白鑒定，凍后細胞仍具有神經干細胞特性，這說明采用等滲透壓差、平衡時間間隔逐漸減小的分步導入

4、方法可以有效地減輕細胞的滲透性損傷和毒性損傷。實驗結果還表明，CPA一次性導入各尺度范圍的神經球所需的滲透平衡時間是隨細胞球的尺度和單位體積細胞數(shù)的增大而增大的。在本實驗所選取的直徑范圍(<100μm)內，對比玻璃化法和常規(guī)慢速凍存法，發(fā)現(xiàn)經過兩種方法凍后細胞的相對活性都隨著神經細胞球尺度的增加而增加，但是采用玻璃化法冷凍保存的神經球，其凍后細胞活性以及其在維持球狀形態(tài)和結構的完整性方面都要顯著好于常規(guī)慢速凍存法。且玻璃化法冷凍保存后的