MMi-0100通過對(duì)心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中MK2的抑制作用降低心肌纖維化程度的研究.pdf

1、背景及目的：
　　缺血性心臟疾病是目前世界上最常見的致死性疾病;在美國，每年有約785000個(gè)人發(fā)生心肌梗死，幾乎每分鐘一個(gè)人。而梗死后心肌的不可逆重塑是導(dǎo)致梗死后心功能不全乃至心衰的主要原因。雖然介入治療-大多數(shù)是早期的再灌注治療-可以增加患者的生存率，但是導(dǎo)致心功能衰竭的心肌不可逆重塑過程卻無法停止。梗死區(qū)域的大小，梗死部位的恢復(fù)以及慢性的左心室重塑決定了最終心力衰竭的程度。為了使梗死后的心力衰竭的程度最小化，在梗死后的早期對(duì)

2、梗死區(qū)域進(jìn)行縮小的治療方案顯得尤為重要。
　　促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK)鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在哺乳動(dòng)物機(jī)體中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)五種不同的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，JNK和p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目

3、前已知的是，p38MAPK在致死性的心肌梗死過程中與心肌細(xì)胞的死亡，心肌梗死后的心力衰竭、心肌纖維化程度及心肌細(xì)胞的肥大密切相關(guān);而絲裂原激活的蛋白激酶激活的蛋白激酶2(MAPKAPK2或者M(jìn)K2)，作為p38 MAPK在細(xì)胞內(nèi)的下游絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，也在很多炎性疾病導(dǎo)致的瘢痕形成及纖維化過程中有涉及。近期關(guān)于MK2-/-小鼠的研究證實(shí)了MK2在p38MAPK通路中的重要作用，并且同時(shí)驗(yàn)證了其與p38誘導(dǎo)的心力衰竭密切相關(guān)。此外

4、，MK2-/-小鼠還可以抵抗缺血再灌注的損傷，這些都提示了在缺血性心臟疾病過程中MK2信號(hào)通路的重要性。
　　近期的研究報(bào)道了一種細(xì)胞浸透性的短肽MMI-0100在一個(gè)小鼠靜脈移植模型中可以抑制術(shù)后炎癥反應(yīng)以及纖維化（內(nèi)膜增生），在一個(gè)豬的博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型中可以減輕肺的纖維化程度，在一個(gè)腹部手術(shù)模型中可以減輕粘連。因此，我們決定對(duì)小鼠急性心肌梗死后通過應(yīng)用MMI-0100抑制MK2信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用的假說進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。<

5、br>　　基于先前的研究成果，我們的研究對(duì)MMI-0100在小鼠體內(nèi)心肌梗死后降低纖維化范圍的假說進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)。我們證實(shí)了在標(biāo)準(zhǔn)的冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)結(jié)扎誘導(dǎo)的鼠類心肌梗死模型中MMI-0100在梗死后2周的時(shí)間點(diǎn)上降低了心肌纖維化程度。已知MK2信號(hào)通路在心肌細(xì)胞死亡、成纖維細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)（其中包括膠原）的分泌（導(dǎo)致纖維化）過程中發(fā)揮重要作用，我們通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MMI-0100在是通過對(duì)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞

6、兩種不同的細(xì)胞分別發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)的心肌保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，MMI-0100在兩種心肌來源的心肌細(xì)胞(H9C2、HL-1)中可以抑制caspase3/7的活性，而在心肌成纖維細(xì)胞中卻能夠增強(qiáng)caspase3/7的活性。這些研究結(jié)果首次報(bào)告了MMI-0100能夠抑制心肌梗死后的心肌纖維化，同時(shí)還闡明了其通過抑制MK2活性進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的凋亡的原理，而且還發(fā)現(xiàn)了其通過對(duì)于心肌成纖維細(xì)胞的直接作用達(dá)到減輕心肌纖維化的目的。

7、　　方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　(1)我們采用了C57BL/6雄性小鼠的心肌梗死模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，心肌梗死模型是通過永久性地結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支獲得。我們將小鼠分5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):1.心肌梗死組:永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支但無MMI-0100注射;2.心肌梗死后治療組:永久結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后1小時(shí)內(nèi)，經(jīng)腹膜腔注射MMI-0100，并每日重復(fù)注射14天(50μ g/kg/ day);3.假手術(shù)組:假手術(shù)組除了不對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎外

8、，其他手術(shù)步驟完全相同;4.正常對(duì)照組:未行手術(shù)及藥物注射;5.單純藥物注射組:未行手術(shù)但每日重復(fù)注射MMI-0100(50μ g/kg/day)14天。期間對(duì)小鼠的心功能（LVEDD;LVESD; LVVol;d; LVVol;s;FS;EF％等指標(biāo)）進(jìn)行測(cè)定分析，共分三個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn):基點(diǎn)，7天和14天。
　　(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析:在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死小鼠，獲取小鼠心臟標(biāo)本并進(jìn)行石蠟包埋，切片，應(yīng)用H&E染色及Mass

9、on's trichrome(MT)染色進(jìn)行心肌纖維化程度的分析;對(duì)組織切片進(jìn)行vimentin，α-SMA，TGF-β1及TUNEL熒光染色以確定組織中不同細(xì)胞組成的改變及對(duì)細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行測(cè)定。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　　(1)原代心肌成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞系的培養(yǎng)
　　我們采用H9C2，HL-1兩種心肌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)方法嚴(yán)格按照已經(jīng)發(fā)表的操作步驟進(jìn)行。
　　(2)缺氧環(huán)境的獲得、缺氧時(shí)間

10、點(diǎn)的確定以及細(xì)胞死亡率的確定。
　　缺氧環(huán)境通過將細(xì)胞置入一個(gè)缺氧培養(yǎng)箱（使用混合的5％C02及95％N2提供一個(gè)1％氧濃度的缺氧環(huán)境）。每種細(xì)胞分3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:1）0.5％ DMSO終濃度組;2)20μ M MMI-0100[溶于終濃度為0.5％的DMSO]組;3）100μ MMMI-0100[溶于終濃度為0.5％的DMSO]組，并取3個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。這些時(shí)間點(diǎn)根據(jù)在缺氧環(huán)境中細(xì)胞的LDH釋放量確定的細(xì)胞死亡程度進(jìn)行選擇:H9C2細(xì)

11、胞系:8小時(shí);16小時(shí);24小時(shí);HL-1細(xì)胞系:4小時(shí);8小時(shí);12小時(shí);心肌成纖維細(xì)胞系:16小時(shí);32小時(shí);48小時(shí)。
　　(3)細(xì)胞死亡及凋亡的分析
　　使用LDH釋放量測(cè)定試劑盒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH進(jìn)行測(cè)定以確定細(xì)胞的死亡率;使用Caspase3/7活性檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解液中Caspase3/7的活性進(jìn)行測(cè)定以確定細(xì)胞的凋亡率。
　　(4) MK2活性的免疫印跡分析
　　我們采用了hnRNPAO，M

12、APK2以及phospho-MAPK2三個(gè)指標(biāo)來對(duì)MK2的活性進(jìn)行分析;
　　(5)細(xì)胞培養(yǎng)基中TNFα，IL-1β及IL-6細(xì)胞因子的分析。
　　我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后的培養(yǎng)基中的TNFα，IL-1β及IL-6等細(xì)胞因子進(jìn)行了定量分析。
　　結(jié)果：
　　1.急性心肌梗死后體內(nèi)應(yīng)用MMI-0100短肽治療可保護(hù)心功能并減輕心室擴(kuò)張。
　　實(shí)驗(yàn)證實(shí):心肌梗死組的左室射血分?jǐn)?shù)(EF％)較假手術(shù)對(duì)照組減少了26％，

13、左室短軸縮短率(FS％)減少了37％。而MMI-0100治療組則將這兩項(xiàng)指標(biāo)的降低分別減少到了12％和20％。MMI-0100還相應(yīng)地緩解了心梗后典型的左心室容積及其舒張末直徑的增加。而單純MMI-0100治療的對(duì)照組顯示其對(duì)正常小鼠的心功能和生存率無影響。
　　2.急性心肌梗死后體內(nèi)應(yīng)用MMI-0100治療可以通過減少心肌細(xì)胞的死亡，同時(shí)增加成纖維細(xì)胞的死亡來減輕心肌纖維化。
　　(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的梗死后心肌組

14、織切片進(jìn)行Masson'strichrome染色的結(jié)果證實(shí)急性心肌梗死后接受MMI-0100治療的實(shí)驗(yàn)組心肌纖維化程度較非治療組減少了50％。而且我們?cè)趯?duì)各組中的有代表性的組織切片進(jìn)行詳盡觀察時(shí)還發(fā)現(xiàn)，MMI-0100治療組切片在相同層面上的切片中的梗死區(qū)要小，而且在梗死區(qū)內(nèi)部可見到有小的存活的心肌細(xì)胞島。而對(duì)組織切片的免疫熒光染色顯示，MMI-0100治療在心梗后可以減少成纖維細(xì)胞的數(shù)量，增加動(dòng)脈密度并且減少了組織切片中TGF-β陽性

15、的細(xì)胞。這一點(diǎn)證實(shí)MMI-0100可能是通過抑制TGF-β的作用（通過MK2的抑制作用）來實(shí)現(xiàn)其降低非梗死區(qū)心肌纖維化程度，從而發(fā)揮保護(hù)心功能的作用的。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，心肌細(xì)胞來源的H9C2細(xì)胞系及HL-1細(xì)胞系在低氧處理后caspase3/7的活性都有相應(yīng)地增強(qiáng)，但在MMI-0100的作用下，這個(gè)預(yù)示著細(xì)胞凋亡信號(hào)的指標(biāo)卻得到了有效的抑制;而原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，MMI-0100卻顯著增強(qiáng)了caspase3

16、/7的活性。而對(duì)細(xì)胞裂解液中蛋白表達(dá)的分析顯示:在H9C2細(xì)胞及HL-1細(xì)胞中，MMI-0100在缺氧處理后明顯抑制了hnRNPAO的表達(dá)，然而MK2及p-MK2的表達(dá)水平都沒有明顯的改變;而大鼠心肌成纖維細(xì)胞中，MMI-0100沒有抑制hnRNPAO的表達(dá)，MK2及p-MK2的蛋白水平也沒有明顯的改變。而這些研究結(jié)果說明MMI-0100在低氧環(huán)境下能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡，而同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的死亡，這或許能夠說明MMI-0100在體內(nèi)