非血緣臍血移植植入前綜合征的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景:
　　異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是目前能夠治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的唯一方法。自1988年世界首例臍血移植(Cord Blood Transplantation，CBT)的成功和世界范圍內(nèi)臍血庫的逐步建立及完善，臍血移植已被許多國家尤其是歐美及日本越來越多地用于多種疾病的治療。世界上多中心大宗病例報道非血緣HLA1～2個位點不合的CBT與非血緣HLA全合的骨髓移植的長期療效相當，從而確定了CBT在兒童和成人造

2、血干細胞移植中的地位。CBT患者在臍血干細胞輸注平均一周左右（即在中性粒細胞植入之前），部分患者會出現(xiàn)一系列免疫反應(yīng)。1994年由Radford等首先提出植入綜合征(engraftment syndrome，ES)這一概念，是指造血干細胞移植(HSCT)術(shù)后中性粒細胞恢復(fù)早期，部分患者出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、腹瀉、黃疸、非心源性的肺水腫、多器官功能衰竭等臨床癥狀的統(tǒng)稱，當時稱之為毛細血管滲漏綜合征（capillary leakage syndr

3、ome，CLS）。隨后人們發(fā)現(xiàn)在CBT術(shù)后，部分患者在中性粒細胞植入前，甚至在未植入的患者中也可出現(xiàn)上述類似的臨床癥狀。2005年日本學者將發(fā)生在CBT后中性粒細胞植入之前，出現(xiàn)的上述一系列免疫反應(yīng)稱之為植入前免疫反應(yīng)(pre-immune response，PIR)，2008年韓國學者稱之為植入前綜合征(pre-engraftment syndrome，PES)。文獻報道PES的相關(guān)臨床與基礎(chǔ)文章較少，PES與臍血干細胞的植入、急性G

4、VHD的發(fā)生、移植相關(guān)死亡率（TRM）、移植后復(fù)發(fā)、長期預(yù)后之間的關(guān)系，以及如何對重癥PES進行干預(yù)治療等，目前均尚不明確。
　　研究目的:
　　本研究分為兩部分即PES的臨床研究和PES的發(fā)病機制研究。
　　第一部分，PES的臨床研究:本中心自2000年4月至2013年12月共240例惡性血液病患者接受了非血緣CBT治療，包括兩個研究階段，即第一階段回顧性臨床研究（自2000年4月至2012年2月，共有137例惡性血

5、液病患者接受非血緣CBT）和第二階段前瞻性臨床研究(自2012年3月至2013年12月，共103例惡性血液病患者接受非血緣CBT)。研究內(nèi)容包括:
　　第一，首先通過回顧性臨床資料分析找出CBT后發(fā)生PES患者的臨床特征。
　　第二，PES對臍血植入及原發(fā)性植入失敗的影響，與移植相關(guān)死亡率及疾病復(fù)發(fā)的相關(guān)性，以及PES對預(yù)后的影響等。
　　第三，PES預(yù)后相關(guān)高危因素研究及病情危險程度分級，制定PES預(yù)后積分系統(tǒng)。

6、r>　　第四，通過前瞻性臨床研究，根據(jù)PES預(yù)后危險程度分級，前瞻性進行分層干預(yù)治療，以期改善重癥PES的不良預(yù)后。
　　第二部分，PES發(fā)病機制的研究:檢測PES患者NK、T細胞亞群的變化，PES伴有腹瀉患者大便中細胞類型的鑒定，PES患者血清中單核巨噬細胞相關(guān)的細胞因子的檢測，以及細胞因子在PES發(fā)生前、發(fā)生時及緩解后的流式檢測結(jié)果，從細胞水平及分泌細胞因子的水平上來尋找引起PES發(fā)病的效應(yīng)細胞。從PES患者血清中篩選出有差異

7、表達的miRNA，在miRNA文庫中尋找其編碼的上游基因，了解其基因?qū)ES發(fā)生所產(chǎn)生的調(diào)控作用，再尋找差異miRNA下游可能作用的靶基因及其相對應(yīng)的信號傳導通路，從分子水平上闡明PES的發(fā)病機理。
　　研究方法:
　　1.非血緣CBT的病例選擇
　　自2000年4月至2013年12月，共有240例高?；驈?fù)發(fā)難治的惡性血液病患者在安徽省立醫(yī)院接受非血緣CBT治療。平均年齡17.9(2.0-48.0)歲，平均體重45.3

8、(12.2-100.5)公斤;男性161例，女性79例?；A(chǔ)疾病包括:急性淋巴細胞白血病119例（其中ph陽性35例），急性髓細胞白血病67例，急性雙表細胞白血病4例;慢性粒細胞白血病31例（其中慢性期12例，加速期/急變期19例）;骨髓增生異常綜合征11例（其中MDS-RCMD5例，MDS-RAEB6例），非霍奇金淋巴瘤7例，青少年型粒單核細胞白血病(JMML)1例。接受CBT時處于完全緩解狀態(tài)者198例，17例患者原發(fā)誘導耐藥，25

9、例復(fù)發(fā)后再誘導治療未緩解。16例患者伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。移植前巨細胞病毒血清學檢測186例陽性(77.5％)。從疾病初診至移植時間平均為9.8(2.6-67.2)月。
　　2.臍血的選擇
　　單份臍血移植HLA≧4/6個位點相合（HLA≥5/6位點相合:冷凍前TNC＞2.5×107/kg，其中CD34細胞＞1.0×105/kg，或TNC＞2.0×107/kg，其中CD34+細胞＞1.2×105/kg。HLA4/6位點相合

10、:冷凍前TNC＞3.5×107/kg，其中CD34+細胞＞1.2×105/kg，或TNC＞3.0×107/kg，其中CD34+細胞＞1.5×105/kg)。如果達不到上述要求者則采用雙份臍血移植，要求TNC＞3.5×107/kg或CD34+細胞＞1.5×105/kg。臍血的輸注:采用中心靜脈緩慢推注15-20分鐘。留取標本檢測每份臍血的TNC、CD34+細胞、CD3+細胞、NK細胞數(shù)量和干/祖細胞培養(yǎng)，臍血袋進行STR-PCR檢測。

11、r>　　3.預(yù)處理方案
　　230例采用清髓性方案即BU/CY2或TBI/CY2為基礎(chǔ)的預(yù)處理方案，10例采用減低強度（Flu/CY/TBI）為基礎(chǔ)的方案。
　　成人AML或ALL患者:fTBI/Ara-C/CY:fTBI（3GYBid×2d，-9～-8天，劑量率5-7cGY/min，肺劑量7GY）/Ara-C（2g/M2q12h×2d，-6～-5天，髓細胞白血病患者在使用Ara-c前加用G-CSF5ug/kg/d至Ara-

12、c結(jié)束）/CY(60mg/kg×2d，-3～-2天)。本方案主要適用于年齡≥14歲，或者存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的患者。
　　兒童ALL患者:BU/CY/Flu:BU（0.8mg/kgq6h×4d，-7～-4天）/CY（60mg/kg×2d，-3～-2天）/Flu（30mg/M2×4d，-9～-6天）。本方案主要適用年齡＜14歲的ALL，或者之前曾經(jīng)接受過中樞神經(jīng)系統(tǒng)放療的ALL患者。
　　兒童AML患者:Ara-c/BU/C

13、Y(AML):Ara-C（2g/M2q12h×2d，-9～-8天，使用Ara-c前加用G-CSF5ug/kg/d至Ara-c結(jié)束），BU(0.8mg/kgq6h×4d，-7～-4天)/CY（60mg/kg×2d，-3～-2天）。本方案主要適用年齡＜14歲的AML，或者之前曾經(jīng)接受過中樞神經(jīng)系統(tǒng)放療的AML患者。
　　4.GVHD的預(yù)防
　　預(yù)防GVHD采用CSA/MMF方案:CSA:2.5～3mg/kg/d，24小時持續(xù)輸注

14、，-1天開始，血清CSA平均濃度維持在250～300ug/ml至30-45天，胃腸道功能恢復(fù)后，按照靜脈劑量的2倍改口服，谷濃度維持200ug/ml，以后根據(jù)是否存在急性GVHD適當減量，4～6月內(nèi)停用。MMF:25mg/kg/d分三次口服，+1天至+30天，無GVHD者減量至停用。
　　5.植入及原發(fā)植入失敗
　　中性粒細胞植入是指移植后連續(xù)3天中性粒細胞絕對值（ANC）≥0.5×109/L。血小板植入是指不依賴血小板懸液

15、輸注連續(xù)7天血小板≥20×109/L。原發(fā)植入失敗是指+42天絕對中性粒細胞計數(shù)(ANC)＜0.5×109/L或骨髓＜10％供者細胞嵌合(STR-PCR)，繼發(fā)植入失敗是指植入后ANC逐漸降低至＜0.5×109/L并且供者細胞比例逐漸減少從而喪失供者植入。
　　6.PES的定義是指在CBT后中性粒細胞植入之前，患者出現(xiàn)不明原因的非感染性發(fā)熱(T≥38.3℃，)同時伴有類似于急性GVHD的紅斑皮疹。患者發(fā)熱經(jīng)過廣譜抗生素治療無效，無

16、明確的感染部位，血液或分泌物培養(yǎng)陰性，需要排除感染性發(fā)熱;患者皮疹需要排除藥物過敏的可能;可以同時伴有體重增加(≥3％)、非感染性腹瀉（每天2次，至少3天）、肝功能異常（轉(zhuǎn)氨酶基值2倍以上或膽紅素≥34mol/L）、腎功能損害（肌酐基值2倍以上）、彌漫性肺部浸潤的非心源性肺水腫及缺氧癥狀、或者不能用其他原因解釋的一過性腦病等。
　　7.統(tǒng)計學分析分類變量采用chi-squaretest，連續(xù)變量采用秩和檢驗進行分析;中性粒細胞或血

17、小板植入、GVHD、感染、復(fù)發(fā)率、以及移植相關(guān)死亡率采用Kapla-Meier曲線分析，按照累計發(fā)生率表示。PES等的高危因素的篩選主要采用Coxregression進行回歸分析。自體造血功能回復(fù)或植入前死亡與中性粒細胞植入、原發(fā)性植入失敗或植入前死亡與GVHD、移植相關(guān)死亡率與復(fù)發(fā)等之間存在競爭風險。所有的資料分析均采用SPSS17.0，部分采用R軟件進行分析（競爭風險）。p＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　8.PES的發(fā)病機制研

18、究
　　檢測PES患者NK、T細胞亞群的變化，PES伴有腹瀉患者大便中細胞類型的鑒定，PES患者血清中NK、T細胞、補體水平、及單核巨噬細胞相關(guān)的細胞因子在PES發(fā)生前、發(fā)生時及緩解后的流式檢測結(jié)果，從細胞水平及細胞因子水平上驗證單核巨噬細胞在PES發(fā)病中的關(guān)鍵作用。從PES患者血清中篩選出有差異表達的miRNA，找出與單核巨噬細胞免疫相關(guān)的miRNA，在miRNA文庫中尋找其編碼的上游基因，了解其基因?qū)ES發(fā)生所產(chǎn)生的調(diào)控作用

19、，再尋找差異miRNA下游可能作用的靶基因及其相對應(yīng)的信號傳導通路，從分子水平上闡明PES的發(fā)病機理。
　　研究結(jié)果:
　　1.PES的高危因素本研究表明清髓性預(yù)處理方案及雙份臍血移植是非血緣CBT患者發(fā)生PES的高危因素，而移植過程中未發(fā)生PES是原發(fā)性植入失敗的高危因素。
　　2000年4月至2012年2月回顧性研究:共有137例惡性血液病患者接受非血緣CBT治療，其中73例患者發(fā)生PES。PES的累計發(fā)生率為53

20、.3％(95％CI，45.9-65.4％)。與未發(fā)生PES的患者相比較，清髓性預(yù)處理方案及雙份臍血移植是PES發(fā)生的高危因素(p=0.008，0.016)。但是兩組在年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、移植時的骨髓狀態(tài)（CR與否）、HLA配型、ABO血型、預(yù)處理是否采用TBI或氟達拉濱的方案、細胞數(shù)（包括TNC、CD34、CD3、CD56計數(shù)）等方面均無明顯統(tǒng)計學差異;在中性粒細胞植入和血小板植入的速率方面兩者之間亦無明顯統(tǒng)計學差異。本階段研究表明原

21、發(fā)性植入失敗均出現(xiàn)在未發(fā)生PES組的患者(21.9％vs0％)，表明未發(fā)生PES是原發(fā)性植入失敗的高危因素(p＜0.001)。
　　2.PES的臨床癥狀充血性皮疹和非感染性發(fā)熱是診斷PES最為特異性的癥狀。
　　臨床癥狀平均出現(xiàn)在臍血移植后第7天(5-15)，第一階段發(fā)生PES的73例患者中，64例患者在14天內(nèi)出現(xiàn)非感染性發(fā)熱(87.6％)，59例患者伴有紅色充血性皮疹(80.8％)，16例患者伴有非感染性腹瀉(21.9％

22、)，11患者出現(xiàn)體重增加(≥3％)(15.1％)，9例患者出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高(12.3％)，5例伴有膽紅素的升高(6.8％)，4例患者出現(xiàn)腎功能的損害(5.5％)，5例患者伴有低氧血癥或肺水腫的表現(xiàn)(6.8％)。對發(fā)生PES與未發(fā)生PES患者的8項主要臨床癥狀進行對比研究，發(fā)現(xiàn)充血性皮疹和非感染性發(fā)熱是診斷PES最為特異性的癥狀，而體重增加、非感染性腹瀉、肝腎功能損害等兩組之間未見明顯差異。
　　3.PES與急性GVHD的關(guān)系PE

23、S與中性粒細胞植入后急性GVHD的發(fā)生具有明顯的正相關(guān)。
　　回顧性研究137例CBT患者，共有34例患者發(fā)生Ⅱ-Ⅳ急性GVHD(24.8％)，Ⅲ-Ⅳ急性GVHD17例(12.4％)。100天Ⅱ-Ⅳ急性GVHD的累計發(fā)生率為25.2％(95％CI，15.6-32.6％)。PES患者發(fā)生急性GVHD的累計發(fā)生率明顯高于未發(fā)生PES的患者。73例PES患者，其中25例(34.2％)患者出現(xiàn)Ⅱ-Ⅳ急性GVHD，100天累計發(fā)生率為35.

24、6％(95％CI，29.3-43.8％);64例未發(fā)生PES的患者，僅9例(14.1％)患者出現(xiàn)Ⅱ-Ⅳ急性GVHD，100天累計發(fā)生率為15.2％(95％CI，8.5-22.6％)，兩組之間具有明顯統(tǒng)計學意義(p=0.019)。
　　4.PES與移植相關(guān)死亡率及復(fù)發(fā)PES的發(fā)生與移植相關(guān)死亡率及疾病復(fù)發(fā)之間無明顯的相關(guān)性。
　　137例CBT患者，51例出現(xiàn)移植相關(guān)死亡(37.2％)。73例PES患者，其中23例出現(xiàn)移植相關(guān)

25、死亡(31.5％)，累計移植相關(guān)死亡率為30.6％(95％CI:20.3％-40.9％);64例未發(fā)生PES組患者28例出現(xiàn)移植相關(guān)死亡(43.8％)，累計移植相關(guān)死亡率為43.5％(95％CI:34.5％-50.2％)。盡管未發(fā)生PES組移植相關(guān)死亡率高于PES組，但是兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異(p=0.10)。共20例患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)(14.5％)。PES組患者10例(13.7％)復(fù)發(fā)，未發(fā)生PES組10例(15.6％)復(fù)發(fā);累計復(fù)發(fā)

26、率分別為13.5％(95％CI:6.6％-19.2％)和15.8％(95％CI:9.5％-22.5％)，兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異（p=0.74）。
　　5.PES與長期生存的關(guān)系及預(yù)后不良的高危因素發(fā)生PES與未發(fā)生PES組患者之間的長期生存無明顯差異。移植后＜7天內(nèi)發(fā)生PES、超過3個以上臨床癥狀、甲基潑尼松龍療效差（一周內(nèi)無效）是PES患者預(yù)后不良的高危因素。
　　生存分析發(fā)現(xiàn)，患者5-yearOS(總生存)和5-yea

27、rMFS（無腫瘤生存）率在PES組和未發(fā)生PES組患者之間均無明顯統(tǒng)計學差異[63.9％(95％CI，58.6％-72.2％)vs59.2％(95％CI,52.1％-66.2％),59.2％(95％CI,50.8.5％-64.3％)vs56.8％(95％CI，48.6％-62.5％)，respectively;p=0.65，0.82]。通過對PES發(fā)生時間、最高體溫、臨床癥狀、環(huán)孢素濃度、甲基潑尼松龍(MP)初始劑量、MP起效的天數(shù)、M

28、P有效維持至減量的天數(shù)、MP治療無效等8項因素進行多因素分析，發(fā)現(xiàn):移植后＜7天內(nèi)發(fā)生PES，超過3個以上臨床癥狀，MP療效差（一周內(nèi)無效）是PES患者預(yù)后不良的高危因素。
　　6.PES積分系統(tǒng)與預(yù)后根據(jù)上述高危因素制定的積分系統(tǒng)表明，發(fā)生PES患者的積分越高(重癥PES)，其移植相關(guān)死亡率就越高，長期生存就越差。
　　將上述多因素分析得出的三個高危因素進行積分。存在一項高危因素計1分，無高危因素為0分。研究表明具有高危因

29、素（1分組+2分組+3分組）患者與0分組患者比較180天TRM明顯升高，分別為(43.6％vs14.8％，p=0.021);具有高危因素2分組+3分組患者與1分組患者比較180天TRM明顯升高，兩組分別為(60.8％vs19.4％，p=0.018);具有高危因素3分組患者與2分組患者比較180天TRM明顯升高，分別為(82.6％vs33.9％，p=0.015);1年的OS四組之間有明顯的差異（0分:82.8％;1分:79.2％;2分:4

30、8.7％;3分:0％）(p＜0.001)。
　　7.PES的分層治療前瞻性對發(fā)生PES患者進行高危分級后采用分層干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療之后重度PES患者的預(yù)后明顯改善。
　　2012年3月至2013年12月前瞻性臨床研究，共103例惡性血液病接受非血緣CBT（發(fā)生PES患者79例）。根據(jù)PES預(yù)后積分系統(tǒng)，采用甲基潑尼松龍(MP)為基礎(chǔ)的干預(yù)治療之后，0分組患者（無高危因素者）（n=26例）與至少有1項以上高危因素者（1分組

31、+2分組+3分組）(n=53例)的移植相關(guān)死亡率、僅1項高危因素（1分組）（n=27例）與至少有2項以上高危因素者(2分組+3分組)的移植相關(guān)死亡率（n=26例）之間均無明顯統(tǒng)計學差異(p=0.16;p=0.39)。對比分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過分層干預(yù)治療之后，2分組+3分組患者1年OS由25.5％（2010年4月至2012年2月）上升至72.3％（2012年3月至2013年12月）(p=0.019)，表明重癥PES患者的預(yù)后明顯改善。
　

32、　8.PES發(fā)生效應(yīng)細胞的鑒定及PES發(fā)生的細胞活化信號途徑
　　實驗研究表明，T淋巴細胞亞群、NK細胞及相關(guān)功能抗原的CD11b、CD27、CD57表達在PES組與未發(fā)生PES組之間無統(tǒng)計學差異;細胞形態(tài)學及流式細胞儀檢測（免疫表型）提示PES伴有腹瀉患者大便中的細胞類型，以單核巨噬細胞占主導;PES患者血清中細胞因子的檢測提示單核巨噬細胞相關(guān)的因子IL-1B、MCP-1、IL-6、IL-18在PES發(fā)生時比移植前顯著增加(p＜

33、0.01)，也顯著高于UCBT同期未發(fā)生PES的患者(p＜0.01)，并且當PES癥狀控制后細胞因子水平明顯下降至移植前的水平。NK/T細胞相關(guān)細胞因子、及補體水平在PES發(fā)生前后，以及PES組患者與未發(fā)生PES的患者之間均無明顯差別(p＞0.05)
　　采用高通量測序的方法檢測了3例CBT患者（9份標本）發(fā)生PES前、發(fā)生時、緩解時血清中的miRNA，結(jié)果顯示差異表達的miRNA有hsa-let-7i-5p、hsa-mir-98

34、-5p、hsa-mir-152-3p、hsa-mir-223-3p等39個，通過靶基因預(yù)測+GO+Pathway分析，推測出PES的發(fā)生與單核巨噬細胞的激活相關(guān)的三條信號通路:Toll、NOD、RIG-Ⅰ樣受體信號通路相關(guān)。
　　結(jié)論及意義:
　　截至目前，文獻檢索表明本研究是報道CBT相關(guān)PES例數(shù)最多、研究最為全面的臨床研究，且首次提出根據(jù)PES高危因素的積分系統(tǒng)進行高危分級并分層干預(yù)治療，國際目前尚未報道。
　　

35、1.通過回顧性及前瞻性臨床研究，發(fā)現(xiàn)清髓性預(yù)處理方案及雙份臍血移植是PES發(fā)生的高危因素，兩組在年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、移植時的骨髓狀態(tài)(CR與否)、HLA配型、ABO血型、預(yù)處理是否采用TBI或氟達拉濱的方案、細胞數(shù)（包括TNC、CD34、CD3、CD56計數(shù)）等方面均無明顯統(tǒng)計學差異。
　　2.本研究對發(fā)生PES患者的主要臨床癥狀進行對比研究，表明充血性皮疹和發(fā)熱是診斷PES最為特異性的癥狀。
　　3.PES與臍血干細胞能

36、否植入密切相關(guān)，臍血移植過程中未發(fā)生PES是原發(fā)性植入失敗的高危因素。多因素分析表明PES是發(fā)生急性GVHD的重要高危因素。
　　4.盡管發(fā)生PES的患者與未發(fā)生PES的患者相比較，患者的移植相關(guān)死亡率及復(fù)發(fā)率無明顯統(tǒng)計學意義，但是相對于輕癥PES來說，重癥PES患者的移植相關(guān)死亡率明顯增加。根據(jù)預(yù)后積分系統(tǒng)對PES患者進行分層治療，能夠明顯改善重癥PES患者的長期生存。
　　5.實驗研究初步證實了單核巨噬細胞是引起PES發(fā)

37、生的效應(yīng)細胞，通過分子水平預(yù)測可能激活Toll、NOD、RIG-Ⅰ樣受體三條分子信號傳導通路而發(fā)揮作用。
　　相對于其他移植類型，CBT最主要的問題是植入失敗及較高的移植相關(guān)死亡率，也是CBT在國內(nèi)開展較少的主要原因。本課題對于CBT后發(fā)生的PES做了較為全面的臨床研究，特別是按照積分系統(tǒng)進行高危分級能夠準確區(qū)分輕癥PES和重癥PES;高危分級后的分層干預(yù)治療，一方面對于保留輕癥PES促進臍血干細胞的植入，克服原發(fā)性植入失敗，另一