喉鱗癌患者樹突狀細胞（DCs）功能及Hep-2總RNA轉(zhuǎn)染DCs抗喉癌的實驗研究.pdf

1、[研究背景與目的]: 喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率處于耳鼻咽喉各部分惡性腫瘤的第三位。在喉癌的病理類型中，以喉鱗癌最為常見，一般占全部喉惡性腫瘤的95～99％。目前喉癌的治療以手術(shù)、放療及化療為主。近年來，雖然手術(shù)、放化療技術(shù)發(fā)展迅速，但喉鱗癌患者特別是晚期患者的的長期生存率在過去10年中未見明顯提高。因此，進一步改善喉癌患者預(yù)后的研究勢在必行。 以往的研究證實，抗腫瘤免疫在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中有重要作用。機

2、體的抗腫瘤免疫應(yīng)答是以T淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答為主。在此過程中，首先由抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)捕獲、加工處理抗原并將抗原信息傳遞給T淋巴細胞，才能進而引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是已知體內(nèi)功能最強的APC，能在體內(nèi)外直接激活初始T細胞(naive T cell)，促進輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的生成，同時也能夠促進B淋巴細胞生

3、成抗體，是啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。 由于DC在體內(nèi)免疫應(yīng)答中重要而獨特的作用，近年來，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療研究越來越受到關(guān)注。已有研究證實，通過體外細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)擴增DC，模擬DC體內(nèi)成熟過程，以不同形式的抗原物質(zhì)，如人工合成腫瘤多肽、腫瘤細胞裂解產(chǎn)物、腫瘤蛋白抗原、凋亡腫瘤細胞、DNA或RNA負載DC，再將致敏DC回輸體內(nèi)作為疫苗可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。樹突狀細胞應(yīng)用于抗喉鱗癌的研究尚處于初級階

4、段。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)喉癌腫瘤特異性抗原，因此腫瘤全抗原成為制備疫苗的主要手段。已有報道應(yīng)用喉癌細胞裂解產(chǎn)物負載樹突狀細胞或用電融合的方法制備疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)，以RNA負載DC能夠引發(fā)更為強大的抗腫瘤效應(yīng)，而且已有實驗證實了其優(yōu)越的安全性及廣闊的應(yīng)用前景。但以RNA負載DC的抗喉鱗癌研究國內(nèi)外尚未見報道。另外，樹突狀細胞免疫學(xué)功能的強弱取決于DC的免疫狀態(tài)。眾所周知，腫瘤患者的DC存在缺陷，但由于T細胞活化的

5、MHC限制性，臨床上應(yīng)用DC誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答必須使用腫瘤患者自身的DC，因而研究惡性腫瘤患者DC的數(shù)目及功能顯得尤為重要。另一方面，雖然DC為基礎(chǔ)的免疫治療有其獨特的優(yōu)勢，但近期內(nèi)仍無法作為主要的臨床治療手段。對于喉鱗癌患者，手術(shù)及放療仍然不失為目前最有效的治療方法。因此研究喉鱗癌患者DC免疫狀態(tài)，除了考慮疾病本身對DC的影響，尚需考慮目前常規(guī)治療方法對DC的影響。 本研究檢測手術(shù)及術(shù)后輔助放療對喉癌患者外周血循環(huán)DC亞型及外

6、周血單核細胞來源DC(monocyte-derived DCs，MoDCs)功能的影響，以探討喉癌免疫治療的時機；同時，以EGFP標(biāo)記的喉癌Hep-2株總：RNA轉(zhuǎn)染MoDCs，研究其誘導(dǎo)Hep-2細胞特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的能力及對喉鱗癌的特異性殺傷效應(yīng)，為臨床以DC為基礎(chǔ)的抗喉癌治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 第一部分 健康人外周血樹突狀細胞亞型檢測及培養(yǎng)、鑒

7、定 [目的] 建立簡便可靠的外周血樹突狀細胞亞型檢測方法，培養(yǎng)鑒定外周血單核細胞來源樹突狀細胞。 [方法] 采集15例健康人外周血，采用三色流式細胞計量術(shù)檢測外周血HLA-DR+lineage-樹突狀細胞及其亞型。myeloid DC(mDC)、plasmacytoid DC(pDC)在外周血WBC所占百分比并計算其絕對數(shù)。采用淋巴細胞分離液自外周血分離獲得單核細胞，體外經(jīng)人重組細胞因子GM-CSF、IL

8、-4和FNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得成熟外周血單核細胞來源DC倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)，透射電鏡觀察DC超微結(jié)構(gòu)，流式細胞儀檢測其表型，混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測刺激自體T淋巴細胞增殖的能力。 [結(jié)果] 健康人LIN-DR+細胞在WBC中所占百分比為0.41±0.13％，絕對數(shù)為22.75+5.22/μl，mDC在WBC中所占百分比為0.28±0.13％，絕對數(shù)為15.12+4.66/μl，pDC在WBC中所占百分比為0.

9、068±0.032％，絕對數(shù)為3.78±1.40/μl；培養(yǎng)獲得具有典型形態(tài)特征的外周血單核細胞來源DC；健康人LIN陰性細胞中，共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)陽性細胞所占百分比分別為46.5±7.1％和51.1±9.6％，同時多數(shù)DC表達DC成熟標(biāo)志CD83和HLA-DR，陽性細胞百分比分別為62.6±10.3％和7.34±8.1％，表明單核細胞經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)后大部分分化為成熟DC；證實少量DC即可刺激自體淋巴細

10、胞產(chǎn)生較強的增殖效應(yīng)。 [結(jié)論]流式細胞儀檢測外周血DC亞群簡便、可靠；聯(lián)合應(yīng)用細胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α能夠自外周血中成功分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)具有典型形態(tài)特征及功能活性的單核細胞來源DC。 　第二部分手術(shù)及術(shù)后放療對喉鱗癌患者外周血樹突狀細胞亞型及功能的影響 [目的]研究手術(shù)及術(shù)后輔助放療對喉鱗癌患者外周血樹突狀細胞亞型及外周血單核細胞來源樹突狀細胞功能的影響。 [方法]采集46例經(jīng)病理證實的

11、喉鱗癌患者及15例健康志愿者外周血。46名喉鱗癌患者中男性44例，女性2例，年齡分布為32～76歲，平均年齡為57.57+10.09歲。根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期13例。46例患者入院后均接受手術(shù)治療，28例患者手術(shù)后接受頸部直線加速器放射治療。接受單純手術(shù)治療的患者(n=18)及接受手術(shù)+放療的患者(n=28)均于治療前、治療中及治療后分三次采集外周血標(biāo)本。采用三

12、色流式細胞計量術(shù)檢測外周血HLA-DR+lineage-樹突狀細胞及其亞型mDC、pDC在外周血WBC所占百分比并計算其絕對數(shù)。采用淋巴細胞分離液自外周血分離獲得單核細胞，體外經(jīng)人重組細胞因子GM-CSF、IL-4和FNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得外周血單核細胞來源DC，流式細胞儀檢測其表型，混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測刺激自體T淋巴細胞增殖的能力。 [結(jié)果]治療前喉鱗癌患者外周血mDC計數(shù)、MoDC表面分子表達及刺激自體T淋巴細胞增

13、殖能力均低于健康人；經(jīng)手術(shù)治療后，接受輔助放療和未接受輔助放療的患者其mDC計數(shù)、MoDC表面分子CD80，CD83，HLA-DR的表達均明顯高于治療前，但僅在術(shù)后未接受輔助放療的患者中觀察到CD86表達及刺激自體T淋巴細胞增殖能力的恢復(fù)。 [結(jié)論]喉鱗癌患者DC存在缺陷；手術(shù)治療可提高喉鱗癌患者外周血mDC計數(shù)及MoDC的功能；術(shù)后輔助放療不影響外周血mDC計數(shù)的正?；?，但對MoDC功能具有抑制作用。 第三部分以EGF

14、P標(biāo)記的喉癌Hep-2細胞株總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的特異性抗喉癌實驗研究 [目的]探討以EGFP為標(biāo)記觀察喉鱗癌Hep-2細胞株總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的可行性；探討轉(zhuǎn)染后DC誘導(dǎo)特異性識別Hep-2細胞的細胞毒性T淋巴細胞的可能性及特異性殺傷效應(yīng)。 [方法]采用淋巴細胞分離液自健康人外周血分離獲得單核細胞，體外經(jīng)人重組細胞因子GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得未成熟DC，觀察細胞形態(tài)，流式細胞技術(shù)鑒定其表型；培養(yǎng)喉癌H

15、ep-2細胞株，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染至Hep-2細胞株，通過G418篩選穩(wěn)定表達EGFP的細胞株；Trizol一步法提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞株總RNA，檢測其完整性及純度；以共孵育及電穿孔法將RNA導(dǎo)入未成熟DC，并以TNF-α促成熟；應(yīng)用熒光顯微鏡觀察并計算轉(zhuǎn)染效率；通過流式細胞技術(shù)、混合淋巴細胞反應(yīng)檢測RNA轉(zhuǎn)染后對DC表型、刺激T細胞增殖能力的影響；將轉(zhuǎn)染后DC與同種異體T淋巴細胞共培養(yǎng)

16、7天，收集效應(yīng)細胞作為特異性CTL，通過51Cr釋放法檢測其對Hep-2細胞株的特異性殺傷效應(yīng)。 [結(jié)果]pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細胞株，經(jīng)G418篩選可獲得穩(wěn)定表達EGFP的細胞株，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，經(jīng)20次傳代后熒光仍無消失，Hep-2細胞形態(tài)及生長特性未見明顯改變；經(jīng)Trizol一步法提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞株總RNA 80～100～μg/107細胞，分光光度法測定OD260/OD280=1.83

17、，RNA電泳顯示18S、28S條帶，證實RNA的完整性；共孵育及電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率分別為7～9％和21～23％；RNA導(dǎo)入未成熟DC后，細胞表達綠色熒光持續(xù)20～24小時；Hep-2-EGFP-RNA轉(zhuǎn)染組DC表面分子CD83、HLA-DR表達較轉(zhuǎn)染前及對照轉(zhuǎn)染組顯著升高，陽性細胞百分比達89.5％、95.4％，刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力顯著提高；Hep-2-EGFP-RNA轉(zhuǎn)染組DC體外誘導(dǎo)的CTLs可特異性殺傷喉癌Hep-2