靶向COX-2，AKT1和PI3Kp85基因的RNAi抑制胃腺癌SGC7901細胞侵襲遷移的體外實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建針對腫瘤相關(guān)基因AKT1、COX-2和PI3Kp85基因的shRNA重組腺病毒質(zhì)粒表達載體,檢測其在胃腺癌細胞株SGC-7901中對.AKT1、COX-2和P13Kp85基因表達的抑制作用,以及敲低靶基因的表達后,觀察MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的表達變化。在體外實驗中檢測腫瘤細胞侵襲和遷移活性的變化,并進一步探討COX-2和P13K/AKT信號通路在胃腺癌侵襲遷移過程中的作用機制。
　　 方法:本課

2、題分兩部分進行:
　　 第一部分:設計可形成小干擾RNA的AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA對應模板DNA序列,克隆至線性化質(zhì)粒PEGFP6-1、PGENESIL-2、PEGFP6-4上,構(gòu)建一個編碼AKT1、COX-2和PI3Kp85三條shRNA的質(zhì)粒表達載體。將此質(zhì)粒亞克隆至腺病毒表達載體上,經(jīng)酶切、測序鑒定正確后包裝擴增并鑒定其病毒滴度,然后轉(zhuǎn)染至SGC7901細胞中檢測其轉(zhuǎn)染率。
　　 第二部分:在

3、體外應用RNA干涉技術(shù),以構(gòu)建的重組腺病毒介導靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的shRNA轉(zhuǎn)染人胃腺癌細胞系SGC-7901后,應用RealtimePCR和Westernblot法檢測目的基因的敲低情況,并用Westernblot法檢測RNAi敲低靶基因的表達后,COX-2及EGFR通路下游侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的蛋白表達變化。應用ELISA檢測轉(zhuǎn)染前后分泌到細胞外的MM9-2和MMP-9的濃

4、度變化。應用劃痕實驗、Transwell實驗、2-D和3-D的Matrigel基質(zhì)生長實驗評價腫瘤細胞轉(zhuǎn)染前后侵襲遷移能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過應用定向克隆、同源重組等技術(shù),獲得一種同時包含靶向COX-2、PI3Kp85和AKT1三條RNA干擾序列的真核表達質(zhì)粒,經(jīng)酶切分析,測序鑒定表明構(gòu)建成功后,擴增并亞克隆至重組腺病毒載體上,獲得重組腺病毒質(zhì)粒表達載體rAd5-C-A-P。由于重組腺病毒質(zhì)粒表達載體上

5、帶有熒光蛋白表達框,所以通過轉(zhuǎn)染SGC-7901后觀察熒光蛋白表達情況,計算轉(zhuǎn)染率>90％。
　　 2.RealtimePCR和Westernblot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA后可明顯敲低靶基因mRNA和蛋白的表達。在靶基因被下調(diào)后通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)COX-2及PI3K/AKT信號通路下游侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9和VEGF的表達水平均明顯降低,而TIMP-2表達上調(diào)。應

6、用ELASA檢測發(fā)現(xiàn)rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9明顯減低,劃痕實驗顯示與對照組和無義序列組相比,rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細胞遷移運動能力明顯減弱,Transwell體外侵襲實驗結(jié)果顯示對照組和無義序列組穿過細胞數(shù)分別為(105±4)、(102.5±6.4),而rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組(26.4±4.6)(p<0.001)。2-D的Matrigel基質(zhì)生長實驗顯示對照組和無義序列組細胞呈正常形態(tài)貼壁生長

7、并融合成片,而rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細胞貼壁能力與遷移能力均明顯減低,3-D的Matrigel基質(zhì)生長實驗顯示與對照組和無義序列組比較,rAd5-C-A-P轉(zhuǎn)染組細胞形成的細胞團塊較小(p<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的重組腺病毒質(zhì)粒表達載體,其能在體外高效轉(zhuǎn)染腫瘤細胞。
　　 2.靶向.AKT1、COX-2和PI3Kp85的RNA干擾技術(shù)可以序列特