狼瘡性腎炎易感基因在小鼠模型中的定位及篩選.pdf

1、目的：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種多基因相關(guān)的自身免疫性疾病,其腎臟損害-狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis,LN)為經(jīng)典的免疫復(fù)合物性腎病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,是多個基因與各種環(huán)境因素相互作用的累加結(jié)果。就個體而言,任何單個基因均不具有決定性意義,不同的遺傳背景及環(huán)境暴露因素決定了個體的不同臨床表型。同時就群體而言,單個易感位點的外顯率很低或呈現(xiàn)不完全外顯,

2、不同的家系因具有不同的基因組合,而表現(xiàn)出不同的SLE發(fā)病過程,即有或沒有LN。
　　 從遺傳學(xué)角度來看,長期的進(jìn)化和社會文明的發(fā)展使人類成為一種高度雜和性物種,具有很高的遺傳變異性。同時由于缺乏對易感基因的自然選擇過程,使各種易感基因遍布于普通人群中。而且因為倫理的原因人類環(huán)境暴露因素、遺傳差異無法控制,如果直接進(jìn)行易感基因定位,要達(dá)到理想的靈敏度及特異性,往往需要采集大量家系或幾百對同胞對DNA標(biāo)本。在實際研究中要獲得如此龐大

3、的均質(zhì)病例十分困難。鼠與人類基因具有高度同源性和同線性,小鼠模型中的研究結(jié)果可直接用于人類相同或相關(guān)基因的研究。
　　 本研究通過建立(NZB×NZW)F1×NZW小鼠模型,以尿蛋白為狼瘡性腎炎表現(xiàn)進(jìn)行全基因組掃描。首先確定NZB(New Zealand Black,NZB)鼠的狼瘡腎炎易感基因在染色體上的位置。然后利用基因組計劃已取得的成果,繞過繁瑣的疊連群-cDNA雜交過程,直接對易感區(qū)域內(nèi)已克隆的基因測序,鑒定出NZB與N

4、ZW(New Zealand White,NZW)之間存在差異的基因。最后利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Comformation Polymorphism,SSCP)電泳技術(shù)分析這些突變基因與狼瘡小鼠蛋白尿的相關(guān)關(guān)系,以探討LN易感基因在小鼠模型中的意義。
　　 材料與方法：
　　 第一部分:選擇(NZB×NZW)F1×NZW雌性回交鼠220只,從4月齡開始每2周測定1次尿蛋白,以監(jiān)測腎臟損傷情況,尿蛋

5、白大于111mg/dl為陽性標(biāo)準(zhǔn)。為便于數(shù)量性狀位點(QTL)分析,腎臟受累程度依尿蛋白濃度分6級:0級＜37mg/dl,1級≥37mg/dl,2級≥74mg/dl,3級≥111mg/dl,4級≥333mg/dl,5級≥1000mg/dl,6級≥3000mg/dl。以酚-氯仿法提取鼠尾基因組DNA標(biāo)本,選定合適的可覆蓋小鼠全部19條染色體的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記進(jìn)行DNA樣本的PCR擴(kuò)增,根據(jù)微衛(wèi)星DNA片段的長度多態(tài)性確定回交鼠的基因型。將全

6、部小鼠的狼瘡性腎炎表現(xiàn)型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)錄入MAPMAKER/QTL及MAPMANAGER/QTL分析軟件包,進(jìn)行基因組掃描以確定NZB來源的狼瘡腎易感基因染色體定位。以LOD值≥3.3為表型與遺傳標(biāo)記間具有顯著連鎖關(guān)系。根據(jù)上述連鎖分析的結(jié)果,將小鼠按不同基因型分組,觀察各組間蛋白尿的時間累積發(fā)生率,確定不同易感位點的相互關(guān)系。組間比較采用x2檢驗,P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 第二部分:利用ISOGEN試劑盒分別提取

7、NZB、NZW小鼠的脾、肝、腎總RNA,RT-PCR合成鼠cDNA。查詢Mouse Genome Informatics(MGI)數(shù)據(jù)庫的表達(dá)基因圖譜,在易感遺傳標(biāo)記附近確定與免疫功能及調(diào)控有關(guān)的候選基因41個,針對基因CDS區(qū)設(shè)計引物69對。熱啟動PCR分別擴(kuò)增上述引物的NZB、NZW鼠cDNA,選取合適PCR產(chǎn)物及相應(yīng)引物進(jìn)行測序,考慮測序精度,大于600bp的片斷全部采用雙向測序。結(jié)果利用Chromas軟件判讀,對存在堿基變異處進(jìn)

8、一步確定有無氨基酸序列變化。
　　 第三部分:(NZB×NZW)F1×NZW回交雌鼠220只,從4月齡開始每2周測定1次尿蛋白,以尿蛋白為指標(biāo)監(jiān)測腎臟損傷情況,尿蛋白大于111mg/dl為狼瘡腎炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。酚-氯仿法提取鼠尾基因組DNA標(biāo)本,以分光光度計測定OD260值,然后將DNA調(diào)至同一濃度8μg/ml,-70℃保存?zhèn)溆?。以Bai2編碼區(qū)mRNA348CAGA缺失為目標(biāo),查詢GeneBank中的DNA序列,設(shè)計SSCP引物F

9、:caggtttgcacacactttgc,R:cgcctcctcctcctcctc,目標(biāo)片斷長度144bp。以Tinagl編碼區(qū)1713C/T為中心設(shè)計引物F:atccacagccacagaagagg,R:agcctggtgcatctttgtct,擴(kuò)增片斷146bp。96孔板在PE9600型PCR儀中擴(kuò)增全部鼠DNA樣本。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand comformation polymorphism,SSCP)具有溫度

10、特異性,隨機(jī)選取10例PCR產(chǎn)物分別在5℃、10℃、15℃、20℃和25℃條件下進(jìn)行篩選,確定合適溫度后,全部樣本進(jìn)行SSCP電泳,銀染后封膜干燥。根據(jù)SSCP電泳帶確定回交鼠基因型,分別將小鼠按有無蛋白尿和不同等位基因分組,觀察各組基因型與蛋白尿的關(guān)系,明確Bai2和Tinag1基因在腎損傷中的作用。數(shù)據(jù)通過x2檢驗,以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:(1)根據(jù)QTL分析,發(fā)現(xiàn)兩個與狼瘡鼠蛋

11、白尿發(fā)生有關(guān)的易感基因位點,分別位于小鼠第4號染色體60cM附近的D4Mit71區(qū)域(LOD＞5)及第17號染色體18cM附近的D17Mit22區(qū)域(LOD＞7)。(2)根據(jù)易感位點基因型的不同,分別將入選小鼠分為純合子(W/W)及雜合子(B/W)兩組進(jìn)行比較,即D4Mit71(B/W)與D4Mit71(W/W)比較,D17Mit22(B/W)與D17Mit22(W/W)比較,發(fā)現(xiàn)無論是D4Mit71還是D17Mit22位點,B/W的尿

12、蛋白累積陽性率均大于W/W型(P＜0.005)。提示(NZBXNZW)F1×NZW回交鼠的狼瘡腎炎易感基因來源于NZB。(3)將全部小鼠按基因型分為4組,即D4BW/D17BW、D4BW/D17WW、D4WW/D17BW、D4WW/D17WW,分別進(jìn)行兩兩組間尿蛋白累積陽性率的比較。結(jié)果顯示D4BW/D17BW小鼠尿蛋白陽性率大于其它三組(P＜0.005),D4WW/D17WW尿蛋白陽性率小于其它三組(P＜0.005),D4BW/D17

13、WW與D4WW/D17BW之間無顯著差異(P＞0.05),但大于D4WW/D17WW組(P＜O.05)。提示攜有兩個B/W位點的小鼠尿蛋白陽性率高于只有一個位點的小鼠。
　　 第二部分;由于基因的表達(dá)受多種因素影響,具有時空特異性,有些轉(zhuǎn)錄本在總RNA中豐度太低無法有效擴(kuò)增,69對引物可擴(kuò)出供測序用樣本90例。對這些基因片段進(jìn)行直接測序,比對NZB和NZW的各自序列,逐一確定單核苷酸差異。共發(fā)現(xiàn)在狼瘡易感區(qū)存在變異的基因11個,

14、突變點41個。查詢GeneBank數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)14個突變點可導(dǎo)致氨基酸序列的改變,影響了Itlna、Tinag1、Bai2、Traf6、Hist3h2bb、Obscn共6個基因的最終表達(dá)產(chǎn)物。
　　 第三部分:(1)根據(jù)SSCP條帶特點確定(NZB×NZW)F1×NZW回交鼠Bai2及Tinag1基因型,將入選小鼠分為純合子(W/W)及雜合子(B/W)兩組進(jìn)行比較,即Bai2B/W與Bai2W/W比較,TinaglB/W與Tin

15、aglW/W比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bai2B/W和TjinaglB/W組的尿蛋白累積陽性率均大于純和W/W型,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算有顯著差異(P＜0.001)。(2)小鼠按不同基因型自由組合可分為4組,即Bai2B/W/TinaglB/W、Bai2B/W/TinaglW/W、Bai2W/W/Tinag1B/W、Bai2W/W/Tinag1W/W。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四組分布極不均勻,Bai2B/W/Tinag1W/W、Bai2W/W/Tinag1B/W兩組個體數(shù)量

16、極少,提示兩者存在緊密連鎖。而Bai2B/W/Tinag1B/W小鼠尿蛋白陽性率明顯大于Bai2W/W/Tinag1W/W組(P＜0.005)。(3)將全部小鼠按蛋白尿分為2組,進(jìn)行兩組間基因分布頻率的比較。結(jié)果顯示小鼠尿蛋白陽性組Bai2B/W及Tinag1B/W基因頻率較陰性組明顯占優(yōu)勢(P＜0.005),而Bai2W/W及Tinag1W/W在尿蛋白陰性組中分布頻率增高(P＜0.005)。提示兩個源于NZB小鼠的基因與動物模型腎臟損

17、傷具有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、NZB第4號染色體的D4Mit71區(qū)域及第17號染色體的D17Mit22區(qū)域為(NZB×NZW)F1×NZW回交鼠的狼瘡腎炎易感基因位點。兩個位點之間具有協(xié)同增效作用。
　　 2、NZB來源的狼瘡易感片斷中存在11個發(fā)生變異的基因,其突變點均發(fā)生在基因結(jié)構(gòu)區(qū)。其中6個基因即Itlna、Tinag1、Bai2、Traf6、Hist3h2bb、Obscn氨基酸序列改變,因其發(fā)生