犬瘟熱病毒H蛋白與不同動物SLAM相互作用致細胞融合效率差異的分子機制.pdf

1、犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一種烈性、高度接觸性傳染病。犬瘟熱病毒屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬，是有囊膜的單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組從3'端到5'端依次編碼6個結構蛋白，其中血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)分別與宿主細胞的細胞膜的結合和融合。病毒特異性受體在宿主細胞表面的表達是病毒侵入的首要條件，也是決定病毒組織嗜性和發(fā)病機理的重要因素。目前，CDV已知的兩種主要細胞受體分別

2、是:信號淋巴細胞激活分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecules，SLAM)和細胞粘附分子-4(nectin-4)，這兩種受體對CDV吸附侵入到宿主體內(nèi)起重要作用。
　　SLAM為犬瘟熱病毒感染宿主免疫細胞的受體，其與CDV H蛋白識別是病毒致病性的基礎。不同動物SLAM可變區(qū)(V)氨基酸差異可影響受體與CDV H相互作用，進而可能導致宿主對CDV易感性的不同。我們前期研究結果表明水貂對

3、CDV易感性低于貉，且同一株CDV在表達貉子SLAM受體的BHK細胞上比在表達水貂SLAM受體的細胞所引起的病毒效價高，進一步比對SLAM氨基酸序列結果顯示水貂和貉SLAM-V區(qū)74和129位氨基酸存在V74I和R129Q突變，我們推測該2個位點氨基酸突變可能改變了CDV H蛋白與SLAM相互作用，并使其誘導的SLAM表達細胞膜融合效率的改變。本研究通過CDV H—SLAM V同源建模，SLAM蛋白74和129位氨基酸定點突變和表達分析

4、及CDV H/F—SLAM細胞融合等實驗，分別在三維結構、蛋白表達、H-SLAM相互作用等水平上開展研究。結果表明SLAM蛋白74和129位氨基酸均位于與CDV H作用界面;74、129位的氨基酸突變未明顯改變水貂、貉SLAM蛋白的表達水平，SLAM-V74I突變降低了其蛋白表達但未影響其細胞融合能力，根據(jù)流式細胞檢測結果顯示，SLAM-V74I表達比例從95.6％下降至91.1％;水貂SLAM-R129Q突變后顯著提高CDV對細胞的融

5、合能力，體現(xiàn)在細胞融合實驗中，其平均合胞體數(shù)目由23.9上升至32.07;而貉SLAM-Q129R突變則顯著降低CDV對細胞的融合能力，其平均合胞體數(shù)目由19.4下降至15.8。該結果初步驗證了我們的猜想，證實了水貂、貉74及129位氨基酸對細胞融合效率的影響。
　　其次，本研究以BHK-21細胞為親本細胞，將pDisplay-mSLAM轉染到細胞中，通過G418壓力篩選并結合有限稀釋法成功構建出穩(wěn)定表達水貂SLAM的單克隆細胞系