督脈電針與TrkC基因修飾MSCs移植聯(lián)合應(yīng)用促進全橫斷脊髓結(jié)構(gòu)和功能修復(fù).pdf

1、本研究旨在探討聯(lián)合應(yīng)用督脈電針(EA)與TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞(TrkC—MSCs)移植治療全橫斷脊髓損傷的大鼠，能否促進移植細胞的存活和分化，軸突的再生和功能的恢復(fù)。并分析其中可能的作用機制，為臨床上治療急性脊髓損傷提供新的治療策略和實驗依據(jù)。本研究分為以下三部分： 第一部分：聯(lián)合應(yīng)用督脈電針與MSCs移植治療全橫斷脊髓損傷的研究 目的：本研究探討督脈電針(EA)與骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植聯(lián)合應(yīng)用能否

2、促進移植的MSCs更好的存活和分化，并促進受損的軸突再生以及全橫斷脊髓功能的恢復(fù)。 方法：從乳鼠股骨和脛骨分離出MSCs，在體外培養(yǎng)擴增和傳代。SD大鼠隨機分為5組，假手術(shù)組，損傷對照組，單純督脈電針(EA)組，MSCs移植(MSCs)組及督脈電針和MSCs移植聯(lián)合(EA+MSCs)組。在大鼠胸T10脊髓段做全橫斷后接受不同的治療。每2周進行一次BBB評分。用ELISA和放射免疫試劑盒分別檢測各組脊髓組織內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)素—3(NT—

3、3)和cAMP表達。術(shù)后8周，在與脊髓橫斷處尾端相隔一個脊髓節(jié)段的部位注射熒光金(Fluorogold，F(xiàn)G)進行逆行標記，并且在大腦皮層體感運動區(qū)注射BDA進行順行標記皮質(zhì)脊髓束。在術(shù)后10周進行脊髓體感誘發(fā)電位和脊髓運動誘發(fā)電位檢測。然后動物灌注，固定取材和冰凍切片，進行一系列的形態(tài)學(xué)研究被執(zhí)行。 結(jié)果： 1.與其它組比較，在EA+MSCs組中脊髓損傷組織內(nèi)的NT—3和cAMP水平顯著增高； 2.BBB評分隨

4、著時間的增加而增高，三個治療組的評分從第2周到第8周都比手術(shù)對照組的有意義的增高。EA+MSCs組的BBB評分有意義的高于其它組。 3.脊髓損傷后，損傷對照組的脊髓體感誘發(fā)電位或脊髓運動誘發(fā)電位的潛伏期增長和峰峰值變小。經(jīng)電針、MSCs移植和聯(lián)合督脈電針與MSCs移植治療后，脊髓體感誘發(fā)電位或脊髓運動誘發(fā)電位都有所不同程度的恢復(fù)。與其它組比較，EA+MSCs組的脊髓體感誘發(fā)電位或脊髓運動誘發(fā)電位的潛伏期有意義的縮短和峰峰值增高。

5、 4.在EA+MSCs組中，在損傷區(qū)內(nèi)單位面積存活的細胞數(shù)多以單純移植MSCs組。并且在EA+MSCs組中移植的MSCs分化為NF150-陽性神經(jīng)元樣細胞和MOSP—陽性的少突膠質(zhì)細胞樣細胞的百分率高于單純移植MSCs組的。 5.在EA+MSCs組中脊髓損傷處的神經(jīng)纖維絲(NF—200)、5-羥色胺能(5-HT)和降鈣素基因相關(guān)肽能(CGRP)陽性神經(jīng)纖維多于其它組，并且有少數(shù)5-HT陽性神經(jīng)纖維穿過損傷區(qū)進入脊髓損傷的

6、尾端。 6.在EA+MSCs組中脊髓損傷處CSPGs的染色范圍縮小，強度減弱；而laminin的染色范圍比較廣。 7.在手術(shù)對照組中BDA陽性的皮質(zhì)脊髓束在離脊髓橫斷處頭側(cè)很遠的地方出現(xiàn)。在EA組、MSCs組和EA+MSCs組中在脊髓損傷處頭側(cè)端附近就能觀察到有較多BDA陽性皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維，并在EA+MSCs組有少量皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維再生進入到脊髓損傷區(qū)。而且在EA+MSCs組中大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞層和中腦紅

7、核內(nèi)有較多的神經(jīng)元被FG標記。 8.EA+MSCs組中大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞層、中腦紅核、及脊髓L1背核存活神經(jīng)元數(shù)目與其它組比較均明顯增多。 結(jié)論：這些結(jié)果表明督脈電針可以促進移植的MSC更好地存活和分化為神經(jīng)元樣細胞；督脈電針與MSCs移植聯(lián)合應(yīng)用能更好地促進脊髓內(nèi)受損傷神經(jīng)纖維的再生和脊髓全橫斷的大鼠部分功能的恢復(fù)。 第二部分：聯(lián)合應(yīng)用督脈電針與TrkC基因修飾MSCs移植治療全橫斷脊髓損傷的研究

8、 目的：探討督脈電針(EA)與TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞(TrkC—MSCs)移植聯(lián)合應(yīng)用能否促進移植的TrkC—MSCs更好的分化為神經(jīng)元，并促進受損的軸突再生以及損傷脊髓功能的恢復(fù)。 方法：從乳鼠股骨分離出MSCs，在體外培養(yǎng)擴增和傳代，并轉(zhuǎn)染LacZ基因和TrkC基因。大鼠分為4組，LacZ—MSCs移植組、EA+LacZ—MSCs組、TrkC—MSCs組和EA+TrkC—MSCs組。在大鼠胸T10脊髓段做全橫斷

9、后接受不同的治療。每2周進行一次BBB評分。用ELISA方法檢測各組脊髓組織內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)素—3(NT—3)的表達。術(shù)后8周，在與脊髓橫斷處尾端相隔一個脊髓節(jié)段的部位注射熒光金(FG)進行逆行標記，并且在大腦皮層體感運動區(qū)注射BDA進行順行標記皮質(zhì)脊髓束。在術(shù)后10周進行脊髓體感誘發(fā)電位和脊髓運動誘發(fā)電位檢測。然后動物灌注，固定取材和冰凍切片，進行一系列的形態(tài)學(xué)研究。另外，EA+MSCs組中有3只大鼠的脊髓損傷區(qū)做投射電鏡和免疫電鏡檢測觀察

10、移植細胞的存活和BDA標記的皮質(zhì)脊髓束再生情況。 結(jié)果： 1.與其它組比較，在EA+TrkC—MSCs組中脊髓損傷區(qū)及鄰近組織內(nèi)的NT—3水平顯著增高； 2.BBB評分隨著時間的增加而增高，EA+TrkC—MSCs組的BBB評分有意義的高于其它組。 3.每組大鼠的脊髓體感誘發(fā)電位和脊髓運動誘發(fā)電位獲得了不同程度的恢復(fù)。與其它組比較，EA+TrkC—MSCs組的脊髓體感誘發(fā)電位或脊髓運動誘發(fā)電位的潛伏期有意

11、義的縮短和峰峰值增高。 4.在EA+TrkC—MSCs組中，移植的TrkC—MSCs分化為NF150-陽性神經(jīng)元樣細胞和MOSP—陽性的少突膠質(zhì)細胞樣細胞的百分率高于其它組的。 5.在EA+TrkC—MSCs組中脊髓損傷處的神經(jīng)纖維絲(NF—200)、5-羥色胺能(5-HT)和降鈣素基因相關(guān)肽能(CGRP)陽性神經(jīng)纖維多于其它組，并且有少數(shù)5-HT陽性神經(jīng)纖維穿過損傷區(qū)進入脊髓損傷的尾端。 6.在EA+TrkC—

12、MSCs組中脊髓損傷處CSPGs的染色范圍縮小并減弱；而laminin的染色范圍比較廣。 7.在EA+LacZ—MSCs組和EA+TrkC—MSCs組中脊髓損傷處頭側(cè)端附近就有較多BDA陽性皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維，并有少數(shù)皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維再生進入到脊髓損傷區(qū)；而且在大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞層和中腦紅核內(nèi)有較多的神經(jīng)元被FG標記。 8.在EA+LacZ—MSCs組和EA+TrkC—MSCs組中大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞

13、層、中腦紅核、及脊髓L1背核存活神經(jīng)元數(shù)目與其它組比較均明顯增多。 9.免疫電鏡觀察到在損傷區(qū)內(nèi)有存活的TrkC—MSCs和再生進入損傷區(qū)內(nèi)的BDA陽性纖維斷面。 結(jié)論：這些結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用督脈電針和TrkC—MSCs移植能更好促進TrkC—MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞，軸突再生進入損傷區(qū)內(nèi)和大鼠全橫斷脊髓功能的恢復(fù)，提示這種聯(lián)合治療是一個有前景的治療脊髓損傷策略。 第三部分：督脈電針與TrkC基因修飾MSCs移植

14、聯(lián)合應(yīng)用對脊髓損傷組織內(nèi)抑制因素和促進因素的影響 目的：探討督脈電針(EA)與TrkC基因修飾MSCs移植聯(lián)合應(yīng)用是否能下調(diào)脊髓損傷組織內(nèi)抑制再生分子CSPGs的表達和上調(diào)促進再生分子laminin的表達，從而促進軸突的再生。 方法：從乳鼠股骨分離出MSCs，在體外培養(yǎng)擴增和傳代，并轉(zhuǎn)染NT—3受體TrkC基因和報告基因LacZ。SD大鼠分為7組：假手術(shù)組、手術(shù)對照組、EA組、MSCs移植組、EA+MSCs組、TrkC—

15、MSCs組和EA+TrkC—MSCs組。在大鼠胸T10脊髓段做全橫斷后接受不同的治療。術(shù)后10周，將各組動物處死，迅速解剖游離出脊髓段。取出含損傷區(qū)的脊髓節(jié)段(約5mm)，迅速放入液氮中。用超聲波細胞粉碎機的探針在蛋白質(zhì)裂解液中將凍存組織勻漿。然后離心，將上清保存在—80℃。樣本蛋白的濃度根據(jù)標準蛋白BSA來測定，然后樣本蛋白上清用蛋白免疫印跡(western blots)技術(shù)分析硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GF

16、AP)，層粘連蛋白(laminin)，和生長相關(guān)蛋白(GAP—43)量的變化。另外，我們執(zhí)行NF/CSPGs、NF/laminin、NF/GFAP和GAP—43/GFAP雙標免疫染色來觀察軸突再生與抑制因素或再生因素的關(guān)系。 結(jié)果：督脈電針組、EA+MSCs組和EA+TrkC—MSCs組有意義地降低了CSPGs和GFAP的表達；laminin和GAP—43的表達只在EA+TrkC—MSCs組增加具有統(tǒng)計學(xué)意義。雙標免疫組化染色結(jié)