紅花黃素腹腔注射聯合MSCs移植對大鼠損傷脊髓修復作用研究.pdf

1、目的：脊髓損傷是一種常見病、多發(fā)病，可以造成損傷平面以下不可逆的感覺、運動及括約肌功能障礙，臨床治療效果不理想，一直是醫(yī)學領域的熱點和難點。本實驗應用對脊髓損傷具有保護作用的紅花黃素腹腔注射聯合MSCs移植治療大鼠脊髓損傷模型，探討紅花黃素腹腔注射和MSCs移植對損傷脊髓修復作用的機制，為提高脊髓損傷臨床治療效果尋找一條可行的途徑。
　　 方法：貼壁分離法分離純化大鼠MSCs，觀察原代及傳代MSCs的形態(tài)特點、生長特性，探討其作

2、為種子細胞的可行性并用流式細胞分析技術鑒定MSCs表面蛋白表達。攜帶GFP基因的腺病毒感染MSCs，熒光顯微鏡觀察MSCs轉染情況并計算轉染效率，觀察GFP-MSCs形態(tài)特點、生長特性，研究GFP標記對MSCs生物學性狀的影響。55只成年S-D大鼠，雌雄各半，根據處理方法的不同，隨機分為5組：A組(紅花黃素腹腔注射+MSCs移植組)、B組(生理鹽水腹腔注射+MSCs移植組)、C組(紅花黃素腹腔注射+PBS組)和D組(生理鹽水腹腔注射+P

3、BS組)，以上每組各10只；E組為補充組，15只。改良Al1en法T7平面制作脊髓損傷模型。造模成功后，A組和B組損傷局部即時直接移植標記后的MSCs(GFP-MSCs)6×106/60μl，C組和D組注射同等體積PBS。A組和C組術后按40mg/kg的劑量腹腔注射紅花黃素，B組和D組注射同等劑量的生理鹽水，每日1次，共用2w。實驗過程中，各組的死亡動物后從E組中隨機選取補充，重新開始計算模型動物的喂養(yǎng)處理時間，以保證各組實驗動物數目的

4、相同。術后1w、2w、3w和4w時采用BBB評分法進行后肢功能評分后心臟灌注取材，制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植的MSCs；HE染色觀察組織形態(tài)學變化；免疫組化檢測GFAP、NeuN和NGF的表達。
　　 結果：
　　 1.貼壁分離法分離純化的貼壁細胞形態(tài)、生長特性與MSCs一致，流式細胞分析技術檢測細胞表面蛋白的表達：CD45陽性率14.47％，CD44陽性率89.26％，CD29陽性率93.27％提示獲得的細胞是M

5、SCs；
　　 2.攜帶GFP基因的腺病毒感染MSCs后，熒光顯微鏡觀察證實MSCs的GFP標記成功，腺病毒的轉染效率為(93％±2％)，轉染后MSCs的形態(tài)學、生長特性無明顯變化；
　　 3.熒光顯微鏡下，GFP-MSCs移植后各個時間點1w、2w、3w和4w時的冰凍組織切片均可觀察到GFP-MSCs發(fā)出的明亮的綠色熒光，證明移植的MSCs可以在大鼠損傷的脊髓中存活；
　　 4.術后2w-4W，紅花黃素腹腔注射

6、或MSCs移植的單獨應用均可提高大鼠BBB評分的得分，二者聯用作用更加明顯，差異有顯著性(P＜0.05)，術后1w時，各組間評分的差異性不顯著(P＞0.05)；
　　 5.術后1w、2w、3w和4w各個時間點冰凍組織切片HE染色顯示紅花黃素腹腔注射或MSCs移植的單獨應用均可改善神經組織病變情況，減少空腔的形成，其改善程度和BBB評分得分情況一致，二者聯用病變作用更加明顯；
　　 6.免疫組化檢測顯示各組GFAP、Neu

7、N和NGF表達均隨著術后時間的延長而增加，相同時間點同一指標A組、B組和C組的表達水平明顯高于D組，差異有顯著性(P＜0.05)，其中A組的表達水平又高于B組和C組，差異有顯著性(P＜0.05)，B組的表達水平高于C組，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.貼壁分離法是一種較好的MSCs分離方法，所獲貼壁細胞生長迅速，活力良好，流式細胞分析技術證實為MSCs，可用作組織工程的種子細胞；
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