eNOS基因修飾EPCs移植與損傷內膜修復的實驗研究.pdf

1、研究背景： 冠心病是嚴重威脅人類健康的一大類疾病，內皮損傷是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)。內皮細胞是覆蓋在血管內膜上的單層細胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機械屏障。內皮細胞可分泌多種血管活性物質，在維持血管舒縮功能、防止血小板黏附和血栓形成以及調節(jié)血管平滑肌細胞的生長和增殖等方面發(fā)揮重要作用。冠心病相關危險因素可導致內皮細胞損傷、凋亡，破壞血管內皮的完整性，繼而引起內膜通透性增加、炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞增生，促進冠心病的發(fā)生、發(fā)展，

2、因此修復損傷的血管內皮對防治冠心病具有重要意義。 內皮修復常需要損傷周邊成熟內皮細胞的遷移和增殖，然而成熟內皮細胞增殖能力低，修復受損內皮能力有限。內皮祖細胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是內皮細胞的前體細胞，表達干細胞和內皮細胞表面標志，具有高增殖潛能及內皮特性。在生理或病理條件下，EPCs可從骨髓動員至外周血，歸巢到血管損傷部位，增殖分化為成熟內皮細胞，促進損傷內皮的修復，同時通過旁分泌作

3、用調節(jié)血管舒縮功能。 方法： 1.pMSCV-eNOS的鑒定與擴增通過RT-PCR及測序進行鑒定；通過反復感染293細胞，擴增攜帶人eNOS基因的重組逆轉錄病毒載體(pMSCV-eNOS)。 2.EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定Ficoll密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞，接種于包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，在添加了20％胎牛血清，50ng/mLVEGF，5ng/mLb-FGF，10ng/mLEGF的M199培養(yǎng)液中常

4、規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長特性及形態(tài)學變化，繪制EPCs生長曲線；通過免疫組化染色鑒定EPCs表面標志eNOS、vWF表達，細胞熒光染色檢測EPCs與UEA-Ⅰ結合及對乙?；兔芏戎鞍?acLDL)攝取特性，測定細胞培養(yǎng)液中NO含量，檢測EPCs分泌NO能力。 3.pMSCV-eNOS轉染對EPCs增殖、黏附、遷移的影響及NO及VEGF的分泌通過病毒感染構建eNOS過表達的EPCs細胞模型，通過綠色熒光蛋自(GFP)

5、的表達，檢測感染效率。用RT-PCR、Western-blot檢測受感染EPCs內eNOS的mRNA和蛋白表達，檢測通過逆轉錄病毒感染能否有效引起EPCs內eNOS的過表達。 采用四氮唑溴鹽比色(MTT)法、改良的Boyden小室和黏附能力測定來觀察pMSCV-eNOS轉染對EPCs增殖、遷移和黏附能力的影響。通過硝酸還原酶法及ELISA法測定EPCs培養(yǎng)液中NO及VEGF含量。 4.pMSCV-eNOS轉染EPCs對內

6、皮細胞及平滑肌細胞增殖、遷移的作用培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞和內皮細胞，將eNOS基因修飾EPCs接種于下室，分別將平滑肌細胞、內皮細胞接種于上室，建立細胞共培養(yǎng)體系，通過MTT法及細胞周期測定分析eNOS基因修飾EPCs對內皮細胞和平滑肌細胞的增殖作用，用遷移計數(shù)方法觀察eNOS基因修飾EPCs對內皮細胞及平滑肌細胞遷移的影響。 5.轉染eNOS基因的EPCs移植在血管內膜修復中的作用建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，將轉染eNOS基因

7、的EPCs通過尾靜脈移植至大鼠體內。損傷后14d取目標血管，通過RT-PCR、WesternBlot方法進行檢測損傷血管局部eNOS的表達情況；行HE染色、伊文氏藍染色計算內膜/中膜面積比及損傷血管再內皮化比例，觀察eNOS基因修飾EPCs移植對損傷血管新生內膜的影響。 結果： 1.鑒定已構建好的pMSCV-eNOS，通過感染293細胞，攜帶人eNOS基因的重組逆轉錄病毒載體(pMSCV-eNOS)得到擴增，獲得較高滴度

8、的病毒液。 2.EPCs培養(yǎng)鑒定細胞培養(yǎng)3-5d可以觀察到細胞增多增大并伸展呈紡錘形或短梭形細胞，有少量細胞突起。培養(yǎng)7-10d，梭形細胞較前明顯增多。 3.pMSCV-eNOS轉染對EPCs部分生物學功能的影響 (1)EPCs轉染效率及轉染后eNOSmRNA和蛋白表達逆轉錄病毒對EPCs轉染率達92％。pMSC-eNOS轉染EPCs后72h，RT-PCR和Westernblot檢測顯示細胞內有eNOS的mRNA

9、和蛋白表達，NOS抑制劑L-NAME可抑制eNOS表達。 (2)pMSCV-eNOS轉染對EPCs增殖能力的影響MTT分析提示pMSCV-eNOS轉染EPCs可增加EPCs的增殖能力(pMSCV-eNOS轉染組vs未轉染組，0.582±0.014vs0.357±0.009，P＜0.01)， (3)pMSCV-eNOS轉染對EPCs遷移功能的影響pMSCV-eNOS轉染組可增加EPCs的遷移能力(pMSCV-eNOS轉染組

10、vs未轉染組，20.50±1.87vs12.17±0.75，P＜0.01)，pMSCV-GFP轉染組與未轉染組之間EPCs的增殖能力無顯著性差異(pMSCV-GFP轉染組vs未轉染組，12.33±1.03vs12.17±0.75，P＞0.05)，而L-NAME可顯著降低轉染后EPCs的遷移能力(pMSCV-eNOS轉染組vsL-NAME干預組，20.50±1.87vs15.50±1.05，P＜0.01)。 (4)pMSCV-eN

11、OS轉染對EPCs黏附功能的影響pMSCV-eNOS轉染后EPCs黏附能力增強(pMSCV-eNOS轉染組vs未轉染組，42.00±1.41vs30.67±0.82，P＜0.01)；pMSCV-GFP轉染組與未轉染組間無顯著性差異(30.67±0.82vs30.00±1.41，P＞0.05)，L-NAME可降低轉染后EPCs的黏附能力(pMSCV-eNOS轉染組vsL-NAME轉染組，42.00±1.41vs34.83±1.17，P＜0

12、.01)。 (5)pMSCV-eNOS轉染對EPCs分泌NO的影響eNOS基因轉染可顯著促進EPCsNO的分泌(pMSCV-eNOS轉染組vs未轉染組，68.32±1.46vs35.13±1.28，P＜0.01)，而抑制劑L-NAME可降低轉染后EPCsNO的分泌(pMSCV-eNOS轉染組vsL-NAME干預組，68.32±1.46vs46.06±2.37，P＜0.01)。 (6)轉染pMSCV-eNOS對EPCs分泌

13、,VEGF的影響pMSCV-eNOS轉染EPCs可明顯促進EPCs分泌VEGF(pMSCV-eNOS轉染組vs未轉染組，203.47±16.26vs153.71±14.17，P＜0.01)，pMSCV-GFP轉染組與未轉染組之間無顯著性差異(156.32±1070vs153.71±14.17，P＞0.05)，L-NAME則抑制了轉染EPCs分泌VEGF的作用(203.47±16.26vs174.96±14.50，P＜0.01)。

14、 4.pMSCV-eNOS轉染EPCs對內皮細胞及平滑肌細胞增殖、遷移的作用pMSCV-eNOS轉染EPCs可促進ECs的增殖(eNOS轉染組vs對照組，0.482±0.009vs0.361±0.009，P＜0.01)、遷移(eNOS轉染組vs對照組，17±1vs11±1，P＜0.01)，促進ECs進入S期(eNOS轉染組vs對照組，62.3±2.32vs43.9±1.21，P＜0.01)；pMSCV-eNOS轉染EPCs可抑制SMCs

15、的增殖(eNOS轉染組vs對照組，0.247±0.006vs0.350±0.004，P＜0.01)、遷移(eNOS轉染組vs對照組，11±1vs26±1，P＜0.01)，增加SMC停留在G1期的比例，抑制SMCs進入S期(eNOS轉染組vs對照組，8.61±0.74vs15.08±1.96，P＜0.01)。 5.轉染eNOS基因的EPCs移植在血管內膜修復中的作用成功建立了大鼠頸動脈損傷模型，損傷后經(jīng)尾靜脈將轉染eNOS基因的E

16、PCs通移植至大鼠體內。損傷后14d取目標血管，RT-PCR、WesternBlot方法檢測損傷血管局部eNOS的mRNA及蛋白表達明顯增加，免疫組化表明eNOS-EPCs移植組損傷血管段eNOS表達明顯增強。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在血管損傷局部存在GFP示蹤的EPCs。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)EPCs移植可明顯抑制新生內膜的過度增殖，而eNOS過表達可進一步加強這種抗增殖效應。Even’sblue染色提示EPCs移植可加速損傷血管處再內皮化過程，

17、eNOS基因修飾的再內皮化作用則更加明顯，再內皮化面積＞50％。對Ach誘導的內皮依賴性血管舒張功能測定后發(fā)現(xiàn)，EPCs移植可改善內皮依賴性血管舒張反應。eNOS基因修飾的EPCs可進一步加強這種效應。 結論： 1.逆轉錄病毒可以安全、有效的轉染EPCs，轉染率達90％以上。pMSCV-eNOS轉染EPCs后72h，RT-PCR和Westernblot檢測顯示細胞內有eNOS的mRNA和蛋白表達，NOS抑制劑L-NAME